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May 17, 2024

Erster direkter Beweis für direkte Zelle

Communications Biology Band 5, Artikelnummer: 1132 (2022) Diesen Artikel zitieren 6900 Zugriffe 7 Zitationen 27 Details zu altmetrischen Metriken Bakterien produzieren polykationische Homopoly(aminosäuren), die sind

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1132 (2022) Diesen Artikel zitieren

6900 Zugriffe

7 Zitate

27 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Bakterien produzieren polykationische Homopoly(aminosäuren), die durch Isopeptid-Rückgrate gekennzeichnet sind. Obwohl die biologische Bedeutung polykationischer Homopoly(aminosäuren) weiterhin unklar ist, richtet sich die Aufmerksamkeit in jüngster Zeit zunehmend auf ihre potenzielle Verwendung zur zellulären Internalisierung. Hier liefern wir zum ersten Mal einen direkten Beweis dafür, dass zwei repräsentative bakterielle polykationische Isopeptide, ε-Poly-l-α-Lysin (ε-PαL) und ε-Oligo-l-β-Lysin (ε-OβL), internalisiert wurden in Säugetierzellen durch direkte Zellmembranpenetration und diffundiert dann im gesamten Zytosol. In dieser Studie verwendeten wir anklickbare ε-PαL- und ε-OβL-Derivate mit einer C-terminalen Azidgruppe, die enzymatisch hergestellt und dann mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert wurden, um die subzelluläre Lokalisierung zu analysieren. Interessanterweise wurden auch fluoreszierende Proteine, die mit dem anklickbaren ε-PαL oder ε-OβL konjugiert waren, in Zellen internalisiert und im gesamten Zytosol diffundiert. Bemerkenswert ist, dass ein Cre-Rekombinase-Konjugat mit ε-PαL in Zellen eindrang und die Cre/loxP-Rekombination vermittelte, und es wurde festgestellt, dass ε-PαL einen IgG-Antikörper voller Länge an das Zytosol und den Zellkern liefert.

Homopoly(aminosäuren), die in der Natur selten vorkommen, werden von Bakterien als Sekundärmetaboliten produziert (Abb. 1a, b und ergänzende Abb. 1a). Bisher wurden sechs Polymere, ε-Poly-l-α-Lysin (ε-PαL, 1)1,2, ε-Oligo-l-β-Lysin (ε-OβL, 2)3, γ-Poly-l/ Es wurden d-Diaminobuttersäure4,5, β-Poly-l-diaminopropionsäure6, ε-Poly-l-β-Lysin (unsere jüngste Entdeckung)7 und γ-Poly-l/d-glutaminsäure1,8 identifiziert. Zusätzlich zu diesen linearen Polymeren, die durch die Isopeptid-Rückgrate gekennzeichnet sind, wurden in Bakterien auch zwei verzweigte Polymere gefunden, die aus wiederholten Dipeptidketten bestehen: Multi-L-Arginyl-Poly-L-Asparaginsäure (auch als Cyanophycin bezeichnet)9,10 und Multi-l-diaminopropionyl-poly-l-diaminopropionsäure11. Unter diesen acht Homopoly(aminosäuren) ist γ-Poly-l/d-glutaminsäure das einzige Beispiel für ein natürlich vorkommendes polyanionisches Isopeptid. Die anderen sind polykationisch und es gibt nur begrenzte Kenntnisse über die antimikrobielle Wirkung der linearen polykationischen Isopeptide. Obwohl die biologische Bedeutung der oben genannten Homopoly(aminosäuren) den Forschern weitgehend verborgen geblieben ist, bilden ihre polyionischen Eigenschaften und Polyamidstrukturen derzeit einen Schwerpunkt in der biologischen Materialwissenschaft.

a, b Chemische Strukturen von ε-PαL (1) und ε-OβL (2). Polymer 1, bestehend aus 25–35 l-αLys-Resten, wird von Streptomyces albulus NBRC14147 als Sekundärmetabolit produziert (a). Oligomer 2 ist eine Unterstruktur von STs. Alle ST-verwandten Verbindungen bestehen aus carbamoyliertem D-Gulosamin, an das 2 (1–7 l-βLys-Reste) und die Amidform der ungewöhnlichen Aminosäure Streptolidin (Streptolidinlactam) gebunden sind. c ε-PαL-Esterderivate, die in dieser Studie vom Stamm NBRC14147 produziert wurden. Ihre C-Termini wurden mit Alkoholen verestert und dem Kulturmedium zugesetzt. Pls katalysierte die Polymerisation von l-αLys und die Veresterungsreaktionen. iαK (hellblaue Kreise), Isopeptid-l-αLys-Monomereinheit. d Die chemische Struktur von R8-Azid (9). Peptid 9 wurde chemisch synthetisiert und als kanonische CPP-Kontrolle verwendet. R (hellviolette Kreise), α-Peptid-L-Arginin-Monomereinheit. e Enzymatisch synthetisiertes ε-OβL-PEG-Azid (19) durch rORF19. iβK (hellblaue Kreise), Isopeptid-l-βLys-Monomereinheit.

Im Gegensatz zu den Isopeptiden mit unbekannter Funktion erregen Standardpeptide (auch Eupeptide genannt) mit Arginin- und/oder Lysin-reichen Sequenzen (typischerweise 5–30 Aminosäurereste) aufgrund ihrer Polykationizität derzeit Interesse für ihre zellpenetrierenden Aktivitäten in Säugetierzellen Merkmale bei physiologischem pH-Wert; Solche Eupeptide werden zellpenetrierende Peptide (CPPs)12,13,14,15 genannt. Obwohl auch amphipathische und hydrophobe CPPs bekannt sind, werden polykationische CPPs häufig als Vehikel zur Abgabe biologischer Makromoleküle (Ladungen) in Säugetierzellen eingesetzt14. Die Internalisierungswege kationischer CPPs lassen sich grob in energieunabhängige direkte Penetration und energieabhängige Endozytose/Makropinozytose14,15 einteilen; Auf beiden Wegen sind die CPP-Bindungen an negativ geladene Zellmembrankomponenten (wie Heparansulfat-Proteoglykane) ein wesentlicher Auslöser für die Internalisierungsereignisse. Im Gegensatz zu den direkten Penetrationswegen müssen die durch Endozytose/Makropinozytose aufgenommenen Ladungen aus den Endosomen in das Zytosol entweichen, um einem Abbau zu entgehen, ihre molekularen Ziele zu erreichen und ihre biologischen Aktivitäten auszuüben. Wichtig ist, dass CPPs, die eine makromolekulare Ladung wie ein Protein tragen, normalerweise nur über einen endozytotischen/makropinozytotischen Weg in Zellen gelangen14,15,16,17. Daher haben sich neuere Arbeiten auf rational gestaltete synthetische CPPs konzentriert, um effizientere Internalisierungen zu erreichen, sowohl um das direkte Eindringen oder endosomale Entweichen der CPP-Protein-Konjugate zu erleichtern als auch um Resistenz gegen proteolytischen Abbau zu verleihen17,18,19,20,21. Zusätzlich zu diesen neuen wegweisenden Gateways sollen verschiedene Ansätze zur Vereinfachung verschiedener Aspekte der Methodik die praktische intrazelluläre Abgabe biologischer Makromoleküle fördern. Darüber hinaus bleiben die schädlichen Auswirkungen der polykationischen Merkmale ein kritisches Problem, das in kanonischen CPPs mit Eupeptidstruktur gelöst werden muss.

In diesem Zusammenhang hat ein aus Bakterien stammendes polykationisches Polymer, ε-PαL (1) (Abb. 1a), in den letzten Jahren als Alternative zu kanonischen kationischen CPPs zunehmendes Interesse geweckt. Polymer 1 zeigt starke antimikrobielle Aktivitäten und nicht nachweisbare Zytotoxizität1,2 sowie eine proteolytische Resistenz aufgrund der Isopeptidbindungen zwischen seinen α-Carboxylgruppen und ε-Aminogruppen22. Jüngste Studien berichteten, dass 1 potenzielle Verbesserungen der zellulären Aufnahme seiner elektrostatischen Gegenstücke, d. h. DNA23,24,25,26, siRNA27 und Arzneimittelmikrokapseln28,29,30,31, zeigte. Allerdings wurden die kationischen Ladungen von 1 größtenteils durch die anionischen Gegenstücke in ihren komplexen Formen neutralisiert, was die Frage aufwirft, wie 1 seine anionischen Ladungen in Zellen transportiert. Darüber hinaus wurde in keinem Bericht der Internalisierungsweg von 1 selbst nachgewiesen, dessen Molekulargewicht (ungefähr 4000) viel höher ist als das der kanonischen CPPs.

Zusätzlich zu 1 finden sich die polykationischen Lysin-Isopeptid-Strukturen auch in Streptothricin (ST)-Antibiotika (Abb. 1b); Ihre Monomereinheiten sind jedoch nicht L-α-Lysin (l-αLys), sondern L-β-Lysin (l-βLys): nämlich ε-OβL (2). STs zeigen antimikrobielle Aktivitäten und Zytotoxizität gegenüber Säugetierzellen. Ihre molekularen Ziele in prokaryotischen Zellen sind die Ribosomen, um die Proteinbiosynthese zu hemmen, ihr zytotoxischer Mechanismus in eukaryotischen Zellen bleibt jedoch unklar. Diese schädlichen Wirkungen werden durch die ε-OβL-Anhängerkette (1–7-mer) verstärkt. Tatsächlich zeigen STs mit einer längeren ε-OβL-Anhängerkette (ST-B, ST-A und ST-X) eine größere Zytotoxizität. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass sich die ε-OβL-Kette wie ein CPP verhält, um die ST-Kernstruktur (ST-F) in die Zellen zu internalisieren.

Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die Isopeptidpolymerstrukturen in 1 und 2 nichtribosomal durch unterschiedliche Mechanismen synthetisiert werden (ergänzende Abbildung 1b, c) 2,3. In dieser Studie haben wir anklickbare Derivate von 1 und 2 erzeugt, indem wir ihre biosynthetischen Enzyme mit den entspannten Substratspezifitäten in den Polymerisationsreaktionen genutzt haben. Anschließend haben wir ihre zellpenetrierenden Aktivitäten mithilfe von Konjugaten mit einem durch Klick-Chemie hergestellten Fluoreszenzfarbstoff aufgeklärt. Dieser Bericht beschreibt weiter die herausragende Internalisierung von 1-Protein- und 2-Protein-Konjugaten in lebende Säugetierzellen. Wir demonstrieren auch die Fähigkeit der ε-PαL-Dekoration, einen IgG-Antikörper voller Länge (150 kDa) in Zellen zu transportieren, was therapeutische Ansätze dramatisch verändern und experimentelle Durchbrüche in der Molekularbiologie fördern könnte.

Die Installation einer anklickbaren funktionellen Gruppe am C-Terminus von 1 ist erforderlich, um Materialien ohne zusätzliche elektrostatische Gegenstücke zu dekorieren; Dieser Ansatz eliminiert nicht die polykationische Eigenschaft von 1. Es gab jedoch eine ganze Reihe erfolgreicher chemischer Ansätze zur Lösung dieses Problems. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass ein ε-PαL-produzierendes Bakterium, Streptomyces albulus NBRC14147, ε-PαL-Esterderivate produzieren kann, wenn das Kulturmedium mit kurzkettigen Polyolen ergänzt wird32. Unsere vorliegende Studie bestätigte auch die Produktion eines Esterderivats im Kulturmedium, das 0,2 % (w/v) Glycerin enthielt; Der C-Terminus von 1 wurde mit Glycerin verestert, wodurch ε-PαL-Glycerin (3) entstand (Abb. 1c, ergänzende Abb. 2a, b und ergänzende Tabellen 1, 2). Die Verkürzung der Isopeptidkette von 3 war eine häufige Beobachtung bei der Veresterung mit kurzkettigen Polyolen32.

Der Veresterungsmechanismus bleibt ungewiss. Diese Ergebnisse ermöglichten es uns jedoch zu untersuchen, ob während des Veresterungsprozesses eine reaktive Gruppe, wie eine Alkin-, Alken- oder Azidgruppe, am C-Terminus von 1 installiert werden könnte. Wir haben zunächst untersucht, ob 2-Propin-1-ol und 3-Buten-1-ol in den C-Terminus eingebaut werden können. Zu diesem Zweck wurde der Stamm NBRC14147 in einem mit 2-Propin-1-ol oder 3-Buten-1-ol ergänzten Medium kultiviert. Die Kulturbrühe wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und hochauflösender Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (HPLC-HR-ESI-MS) analysiert. Wie erwartet führten 0,2 % (Gew./Vol.) Zusätze dieser beiden Alkohole zur Produktion der entsprechenden Esterderivate (Ergänzungsabbildungen 2c, d und Ergänzungstabellen 3, 4). In ähnlicher Weise wurden auch drei weitere Alkohole, Polyethylenglykol (PEG), Triethylenglykolmono(2-propinyl)ether (PEG-Alkin) und 11-Azido-3,6,9-trioxaundecanol (PEG-Azid), in das eingebaut C-Terminus von 1 über eine Esterbindung (Ergänzungsabbildung 2e – g und Ergänzungstabellen 5–7). Diese Veresterungsreaktionen traten bei etwa 70 % des produzierten ε-PαL auf (Ergänzungstabelle 8). Wir haben außerdem gezeigt, dass die rekombinante ε-PαL-Synthetase (rPls) in vitro zwei Esterderivate, ε-PαL-Glycerin (3) und ε-PαL-PEG (6), in der Reaktionsmischung produzierte, die Glycerin bzw. PEG enthielt (Ergänzende Abbildung 3 und ergänzende Tabellen 9, 10). Diese Ergebnisse zeigten, dass rPls die Veresterungsreaktionen direkt katalysierte.

Unter den ε-PαL-Esterderivaten wurde ε-PαL-PEG-Azid (8) aus der Kulturbrühe gereinigt und für weitere Experimente verwendet, nachdem seine chemische Struktur durch NMR-Analyse bestätigt wurde (Ergänzungstabelle 11).

Um 1 fluoreszierend zu markieren, wurde Verbindung 8 durch Klickreaktion (kupferfreie Azid-Alkin-Cycloaddition) kovalent an ein Fluorescein-Derivat (FAM, 0,4 kDa) gebunden, das eine Dibenzocyclooctin-Gruppe (DBCO) trägt (Ergänzungstabelle 12). Die resultierende Verbindung ε-PαL-FAM (10) (Abb. 2) wurde dann verwendet, um die zellpenetrierende Aktivität von 1 zu untersuchen.

Ein Fluoresceinfarbstoff (FAM) und Proteine ​​(mAG, mKO und mAb) wurden durch Klick-Chemie mit ε-PαL, R8 oder ε-OβLm konjugiert. Die resultierenden Produkte sind schematisch dargestellt. Ihre durch HPLC-HR-ESI-MS-Daten validierten chemischen Strukturen sind in den Ergänzungstabellen aufgeführt. Unsere vorliegende Studie zeigte die dominanten Wege für ihre intrazelluläre Aufnahme (unten rechts). Die Verbindungen 10, 12, 14, 16 und 24 wurden hauptsächlich durch direkte Penetration in Zellen internalisiert. Allerdings wurden 17 und 25 durch Endozytose und/oder Makropinozytose in Zellen aufgenommen und dann aus Endosomen freigesetzt. Die Verbindungen 11, 13 und 15 wurden als kanonische CPP-Kontrollen verwendet.

Konfokale Mikroskopie (CM) wurde zunächst eingesetzt, um die zelluläre Internalisierung von 10 zu beurteilen (Abb. 3a). HeLa-Zellen wurden mit 10 (50 µM) unter typischen Zellkulturbedingungen mit Serum inkubiert. Vor der Bildgebung wurden die Zellen mit Heparin gewaschen, das stark negativ geladen ist und 10 elektrostatisch mit der Plasmamembranoberfläche verbundene Zellen entfernen sollte. Anschließend wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd14 fixiert. Bei der 60-minütigen Inkubation bei 37 °C zeigte CM, dass 10 in Zellen internalisiert und im gesamten Zytosol diffundiert wurde. Das beobachtete grün fluoreszierende Bild zeigte den direkten Translokationsweg für 10 an, da keine punktuellen Signale vorhanden waren, die auf Endosomen hindeuteten. Darüber hinaus wurden diffuse Signale von 10 auch bei der intrazellulären Aufnahme bei 4 °C beobachtet, einer Temperatur, bei der die energieabhängige Endozytose stark unterdrückt war. Diese Ergebnisse zeigten, dass die zelluläre Internalisierung von 10 über einen direkten Penetrationsweg erfolgte. Eine niedrige Konzentration (2 µM) von 10 ergab jedoch nur punktförmige Signale, die auf Endosomen bei 37 °C hindeuteten (Abb. 3b). Über diese dosisabhängigen Signale (diffus oder punktuell) wurde in kanonischen synthetischen CPPs wie Octa-Arginin (R8) und Dodeca-Arginin (R12)33,34 berichtet. Wir haben tatsächlich solche Signale bei der Behandlung mit R8-FAM (11) beobachtet (Abb. 2 und Abb. 3a, b). Daher gelangte 1 wie R8 auf zwei Wegen in die Zellen: direkte Penetration und Endozytose/Makropinozytose. Für diese Internalisierung war die Konjugation kovalenter Bindungen erforderlich; Ein nichtkovalenter Ansatz führte zu keiner Zellaufnahme (Abb. 3c). Das Serum im Kulturmedium hatte keinen Einfluss auf das zelluläre Internalisierungsverhältnis (Abb. 3c), aber polyanionisches Heparin hemmte das Zelldurchdringungsereignis signifikant (Abb. 3d), was stark darauf hindeutet, dass negativ geladene Membrankomponenten, einschließlich Heparansulfat-Proteoglykan, essentiell dafür sind die ε-PαL-Internalisierung. Darüber hinaus kam es bei 4 °C und 37 °C zu einer schnellen zellulären Aufnahme (innerhalb von 5–15 Minuten) und einer dosisabhängigen Aufnahme von 10 (Abb. 3e–h). PAO (ein Endozytose-Inhibitor)35 und EIPA (ein Makropinozytose-Inhibitor)36 unterdrückten diese zelluläre Aufnahme (Abb. 3i). Allerdings waren die Hemmgrade um 11 niedriger als bei 11 (Abb. 3j), was darauf hindeutet, dass der Hauptweg für die ε-PαL-Internalisierung die direkte Penetration durch die Zellmembranen ist. Daher richteten wir unsere Aufmerksamkeit auf den zytosolischen Transport von Proteinladungen durch 1.

a, b Zytosolische Abgabe von FAM konjugiert mit ε-PαL (1) oder R8. HeLa-Zellen wurden mit FAM, ε-PαL-FAM (10) und R8-FAM (11) unter typischen Zellkulturbedingungen mit Serum inkubiert. Nach dem Waschen und Fixieren der Zellen wurde die zelluläre Lokalisierung (grün) von FAM, 10 und 11 durch konfokale Mikroskopie (CM) bestimmt. Die Zellmembran wurde mit dem Membranmarker Weizenkeimagglutinin (Alexa594-WGA; rot) angefärbt. Es werden die repräsentativen CM-Bilder und die vergrößerten Ansichten der gelb umrandeten Bereiche angezeigt. Maßstabsbalken, 20 µm. Die Zellen wurden mit jeweils 50 µM FAM, 10 und 11 60 Minuten lang bei 37 °C und 4 °C inkubiert (a). Die Zellen wurden mit jeweils 2 µM 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert (b). c–j Relative zelluläre Aufnahme von 10 bei 37 °C (hellgrau) und 4 °C (weiß). FAM (50 µM), FAM gemischt mit 1 (FAM + 1, jeweils 50 µM) und 10 (50 µM) wurden mit Zellen im Kulturmedium, ergänzt mit oder ohne Serum (FBS), 60 Minuten lang inkubiert (c). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (sd) (n = 3) dargestellt. **Signifikant bei p < 0,01 durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. ns nicht signifikant. Verbindung 10 wurde mit Zellen im Kulturmedium, ergänzt mit oder ohne mg ml-1 Heparin, 60 Minuten lang bei 37 °C (d) inkubiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. **Signifikant bei p < 0,01 gemäß ungepaartem Student-t-Test. Verbindung 10 wurde mit Zellen 5–60 Minuten lang bei 4 °C (e) und 37 °C (f) inkubiert. Verbindung 10 (3,1–100 µM) wurde mit Zellen 60 Minuten lang bei 4 °C (g) und 37 °C (h) inkubiert. Die Verbindungen 10 (i) und 11 (j) wurden mit Zellen 60 Minuten lang bei 37 °C im Kulturmedium inkubiert, das mit einem Endozytose-/Makropinozytose-Inhibitor (PAO, Dynasore, MDC oder EIPA) ergänzt war. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. Sternchen zeigen die Signifikanz bei *p < 0,05, **p < 0,01 anhand einer einfaktoriellen ANOVA gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest an.

Ein grün fluoreszierendes Protein mit 27 kDa, das monomere Azami-Green (mAG), wurde chemisch mit DBCO-Sulfo-N-hydroxysuccinimidylester derivatisiert, um eine DBCO-Gruppe auf der mAG-Oberfläche einzuführen, und anschließend durch Klickreaktion mit 8 konjugiert, was ε-PαL ergab -mAG (12) (Abb. 2, Ergänzungstabelle 13). HeLa-Zellen wurden mit 12 (50 µM) 60 Minuten lang bei 37 °C oder 4 °C inkubiert und dann wie oben beschrieben gewaschen und fixiert. Als die Zellen bei 37 °C inkubiert wurden, ergab die CM-Analyse diffuse und vesikuläre Signale (Abb. 4a). Die Inkubation bei 4 °C führte zu kondensierten Fluoreszenzsignalen innerhalb der Kerne und diffusen grün fluoreszierenden Signalen in Zytosolen (Abb. 4a). Während das Konjugat mit 12 kovalenten Bindungen die Proteinfracht in Zellen transportieren konnte, führte ein nichtkovalenter Ansatz zu keiner zellulären Aufnahme (Abb. 4b). Trotz der großen Ladung (27 kDa) gelangte 12 innerhalb von 5–15 Minuten schnell in die Zellen, und seine dosisabhängige Aufnahme wurde auch bei 4 °C und 37 °C gezeigt (Abb. 4c – f). Endozytose-/Makropinozytose-Inhibitoren haben die zelluläre Internalisierung nicht aufgehoben (Abb. 4g). Im Gegensatz zu 12 wurde mit R8 (R8-mAG, 13) konjugiertes mAG (Abb. 2, Ergänzungstabelle 14) bei 4 ° C kaum in Zellen internalisiert und bei 37 ° C in Endosomen eingeschlossen (Abb. 4a).

eine zytosolische Abgabe von mAG, konjugiert mit ε-PαL (1) oder R8. HeLa-Zellen wurden mit mAG, ε-PαL-mAG (12) und R8-mAG (13) 60 Minuten lang bei 37 °C und 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen und Fixieren der Zellen wurde die zelluläre Lokalisierung von 12 (grün) und 13 (grün) mittels CM bestimmt. Die Zellmembran wurde mit Alexa594-WGA (rot) gefärbt. Es werden die repräsentativen CM-Bilder und die vergrößerten Ansichten der gelb umrandeten Bereiche angezeigt. Maßstabsbalken, 20 µm. b–g Relative zelluläre Aufnahme von 12 bei 37 °C (hellgrau) und 4 °C (weiß). mAG, mAG gemischt mit 1 (mAG + 1) und 12 wurden mit HeLa-Zellen 60 Minuten lang bei 37 °C und 4 °C inkubiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. **Signifikant bei p < 0,01 durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest (b). Protein 12 (50 µM) wurde mit Zellen 5–60 Minuten lang bei 4 °C (c) und 37 °C (d) inkubiert. Protein 12 (3,1–100 µM) wurde mit Zellen 60 Minuten lang bei 4 °C (e) und 37 °C (f) inkubiert. Wirkung von Endozytose-/Makropinozytose-Inhibitoren auf die zelluläre Aufnahme von 12. HeLa-Zellen wurden mit 12 60 Minuten lang bei 37 °C in dem mit dem Inhibitor ergänzten Kulturmedium (PAO, Dynasore, MDC oder EIPA) inkubiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. *Signifikant bei p < 0,05 durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest (g).

Um das direkte Penetrationsereignis bei 12 zu bestätigen, führten wir eine Zeitrafferaufnahme mit CM durch. Bemerkenswerterweise zeigte 12 die Bildung von fluoreszenzangereicherten Flecken auf den Zellmembranen in der anfänglichen Internalisierungsphase (Abb. 5a) (Zusatzvideo 1). Von den Flecken aus breiten sich 12 dann nach und nach im Zytosol und Zellkern aus. Solche Flecken wurden auch während des direkten Penetrationsprozesses kanonischer Arginin-reicher Peptide beobachtet und wurden zuvor als Nukleationszonen (NZs) beschrieben14,37,38. ε-PαL (Isopeptid) und argininreiche Peptide (Eupeptid) sollten strukturell in verschiedene Klassen eingeteilt werden, aber interessanterweise kann ε-PαL Proteinladungen über NZ direkt und sehr schnell in Zellen transportieren. In CPPs mit α-Helix-Konformationen wurden drei direkte Penetrationsmechanismen vorgeschlagen (Abb. 5a)15. Es wurde vermutet, dass ε-PαL eine β-Faltblatt-Konformation bildet39,40. Obwohl der intrazelluläre Aufnahmemechanismus unklar bleibt, wurden die zelluläre Aufnahme und die zytosolische Verteilung von 12 in allen getesteten Zelllinien beobachtet (ergänzende Abbildung 4). Um die Vielseitigkeit des ε-PαL-Vehikels für die zytosolische Abgabe zu untersuchen, wurde ein alternatives fluoreszierendes Protein, das monomere Kusabira-Orange (mKO, 25 kDa), mit 8 konjugiert, was ε-PαL-mKO (14) ergab (Abb. 2 und Ergänzung). Tabelle 15). Wie erwartet wurden mit 14 identische Ergebnisse erzielt (ergänzende Abbildung 5). Mit R8 (R8-mKO) (15) konjugiertes mKO (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 16) wurde erst bei Inkubation bei 37 °C wieder aufgenommen. Darüber hinaus bestätigte die Zeitraffer-Bildgebung mit CM, dass die zelluläre Internalisierung nur über den endozytischen Weg erfolgte (Ergänzungsvideo 2). Diese Ergebnisse zeigten, dass die polykationische Modifikation durch ε-PαL für die zytosolische Abgabe von Proteinladungen sehr effektiv ist.

ein Zeitrafferexperiment, das die zelluläre Aufnahme von 12 zeigt. Die Zeitrafferaufnahme zeigte HeLa-Zellen mit CM nach der Zugabe von 12 bei 37 °C. Nach 1, 5, 10, 15 und 20 Minuten werden die Schnappschüsse angezeigt (siehe auch Zusatzvideo 1). Neuseeland, Nukleationszone. Maßstabsbalken, 20 µm. Die vorgeschlagenen direkten Penetrationsmechanismen sind schematisch dargestellt (unten). b Das in dieser Studie konstruierte Cre-Aktivitätsreporterplasmid ist schematisch dargestellt. Das Reporterplasmid exprimierte ein Fusionsfluoreszenzprotein (mKO-mAG) und mKO allein in HeLa-Zellen mit bzw. ohne Cre-Rekombinase. HEK293T-Zellen wurden mit dem Reporterplasmid transfiziert und dann 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden nach Bestätigung der mKO-Expression 60 Minuten lang bei 37 °C mit Cre-Rekombinase (50 μM) oder ε-PαL-Cre (16) (50 μM) behandelt. Die Zellen wurden nach dem Waschen 24 Stunden lang unter typischen Kulturbedingungen inkubiert. Das Gen-Rekombinationsereignis von 16 wurde durch Mikroskopie überwacht. Die repräsentativen Mikroskopiebilder werden angezeigt. Die Gen-Rekombinationsverhältnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. Maßstabsbalken, 20 µm.

Die Verfolgung von CPP-Protein-Konjugaten nach ihrer intrazellulären Aufnahme ist wichtig für die Bewertung ihrer Kapazitäten als CPPs. Wir untersuchten daher die dynamische Verteilung des intrazellulären 12. Zeitrafferaufnahmen mit optischer Schnittmikroskopie zeigten, dass das diffuse Signal von 12 mindestens 12 Stunden lang kontinuierlich erfasst wurde (Zusatzvideo 3). Im Gegensatz dazu wurden die R8-mKO (15)-Signale bis zu 12 Stunden lang kontinuierlich als vesikuläre Formen nachgewiesen (Zusatzvideo 4). Somit waren die meisten der 15 Moleküle ständig in Endosomen gefangen.

Um zu untersuchen, ob die von ε-PαL gelieferten Enzymladungen ihre Funktionen in Zellen ausüben, haben wir Cre-Rekombinase (38 kDa) hergestellt, konjugiert mit 8 (ε-PαL-Cre, 16) (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 17). Wir transfizierten zunächst HEK293T-Zellen mit einem Cre-Aktivitätsreporterplasmid (pmKO_loxP_mAG), das ein mKO-mAG-Fusionsprotein und mKO allein mit bzw. ohne 16 exprimiert. Anschließend behandelten wir die transfizierten Zellen mit 50 μM 16 und überwachten die Reportergenexpression mikroskopisch. Wie erwartet führte die Zugabe von 16 zur Expression von mKO-mAG, was die erfolgreiche Abgabe und Wirkung (Cre/loxP-Rekombination) von 16 demonstrierte (Abb. 5b).

Die Erfolge der ε-PαL-gesteuerten intrazellulären Abgabe von mAG (27 kDa), mKO (25 kDa) und Cre-Rekombinase (38 kDa) haben unsere Aufmerksamkeit auf die Abgabe eines IgG-Antikörpers in voller Länge gelenkt, was immer noch eine Herausforderung darstellt sein hohes Molekulargewicht (150 kDa)41. Um die Fähigkeit von ε-PαL zur Antikörper-Internalisierung zu untersuchen, wurde ein fluoreszierend markierter monoklonaler Anti-α-Tubulin-Antikörper (mAbFAM) mit 8 konjugiert, was ε-PαL-mAbFAM (17) ergab (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 18). Wir vermuteten, dass eine Behandlung mit hoher Konzentration (50 μM) aufgrund übermäßiger Fluoreszenzsignale kein Fluoreszenzbild des mikrofilamentösen Zytoskeletts liefern könnte. Im Gegensatz dazu würde die niedrige Konzentration (z. B. ~2 μM) nur zu punktuellen Signalen führen, die auf Endosomen hinweisen. Daher wurden HeLa-Zellen mit 10 µM 17 inkubiert. Nach der Inkubation für 2 Stunden bei 37 °C und 4 °C ergab die CM-Analyse sowohl diffuse als auch punktuelle Signale von 17 in den bei 37 °C inkubierten Zellen, nicht jedoch in den inkubierten bei 4 °C (Abb. 6a). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass 17, das hauptsächlich durch Endozytose und/oder Makropinozytose aufgenommen wurde, aus den Endosomen freigesetzt und in der Zelle verteilt wurde. Noch überraschender war, dass die kondensierten Fluoreszenzsignale auch innerhalb von Kernen nachgewiesen wurden. Umgekehrt lieferte 17 kein Fluoreszenzbild des mikrofilamentösen Zytoskeletts, obwohl dies bei 17 in einem Standard-Immunfärbungsexperiment der Fall war (Abb. 6b). Die zytosolisch verbreiteten Signale von 17 resultierten wahrscheinlich aus dem überschüssigen und nicht an α-Tubulin gebundenen 17, das in den lebenden Zellen nicht entfernt werden kann.

a-HeLa-Zellen wurden mit ε-PαL-mAbFAM (17) 120 Minuten lang bei 37 °C und 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen und Fixieren der Zellen wurde die zelluläre Lokalisierung von 17 (grün) mittels CM bestimmt. Die Zellmembran wurde mit Alexa594-WGA (rot) gefärbt. Es werden repräsentative CM-Bilder und vergrößerte Ansichten der gelb umrandeten Bereiche angezeigt. Maßstabsbalken, 20 µm. b Immunfärbung von α-Tubulin durch 17 in HeLa-Zellen. Die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, in 0,1 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert und dann in einem Blockierungsreagenz (Blocking One) blockiert. Anschließend wurden die Zellen mit 17 bei 2 μg ml−1 (grün dargestellt) 60 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen wurde die Zellmembran mit Alexa594-WGA (rot) gefärbt und die Zellen anschließend mittels CM beobachtet. Maßstabsbalken, 20 µm.

Um der wachsenden weltweiten Nachfrage nach CPPs gerecht zu werden, sind strukturell und funktionell unterschiedliche CPPs erforderlich, um die kanonischen CPP-Nachteile wie Zytotoxizität zu umgehen. Diese Studie konzentrierte sich daher auf die Zytotoxizität von ε-PαL (1) gegenüber Säugetierzellen, während auch über die Nichttoxizität von 1 in vivo berichtet wurde, sodass ε-PαL in mehreren Ländern als natürliches Lebensmittelkonservierungsmittel verwendet wird1,42. Allerdings blieb die In-vitro-Zytotoxizität von 1 in anderen Zelllinien unklar. Wir führten daher den MTT-Zelllebensfähigkeitstest mit 1 zusätzlich zu HeLa-Zellen in K562-, HepG2- und HEK293T-Zellen durch und bestätigten, dass 1 in diesen Zelllinien keine Zytotoxizität aufwies (Ergänzungstabelle 19).

Wie bereits erwähnt, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass sich die ε-OβL-Einheit (2) wie ein CPP verhält, um die ST-Kernstruktur (ST-F) in Zellen zu internalisieren (Abb. 1b). Wir untersuchten daher die zellpenetrierende Aktivität von 2 in Säugetierzellen. Wir verwendeten einen chemoenzymatischen Ansatz, um eine Azidgruppe am C-Terminus von 2 einzuführen.

Bei der ST-Biosynthese wird das Wachstum der ε-OβL-Kette (2–7-mer) durch ORF19 vermittelt, eine eigenständige Adenylierungsdomäne der nichtribosomalen Peptidsynthetase (NRPS) (ergänzende Abbildung 1c)3. Bei dieser Kettenverlängerungsreaktion oligomerisiert ORF19 niemals direkt nur mit l-βLys-Monomereinheiten; vielmehr erfordert ORF19 das an 4'PP-ORF18 gebundene l-βLys-Gerüst als Priming-Einheit3. Aminoacyl-N-acetylcysteaminthioester (Aminoacyl-SNACs) werden häufig als Nachahmungssubstrate des an den 4′-PP-Arm gebundenen Aminoacylsubstrats verwendet43. Anstelle der Aminoacyl-SNACs untersuchten wir jedoch, ob l-βLys, gebunden an einen chemisch synthetisierten PEG-Azid-Schwanz (l-βLys-PEG-Azid, 18) (Abb. 1e und Ergänzungstabelle 20), als Grundierung akzeptabel wäre Einheit für rekombinantes ORF19 (rORF19). Wir inkubierten Verbindung 18 (Priming-Einheit) und l-βLys (Extending-Einheit) mit rORF19 (0,1 mg ml−1) und ATP. Glücklicherweise zeigte die HPLC-ESI-HR-TOF-Analyse der Reaktionsmischung, dass rORF19 eine ATP-abhängige Kettenverlängerung (2–4-mer) am 18-Gerüst vermittelte und ε-OβL-PEG-Azid (19) produzierte (Abb. 1e, ergänzende Abb. 6a, b und ergänzende Tabelle 21). Dieser Befund zeigte, dass 18 als Priming-Einheit akzeptabel ist. Wir untersuchten auch drei verschiedene Priming-Einheiten (ergänzende Abbildung 6a), basierend auf der Substratspezifität von ORF19, über die unsere Gruppe zuvor berichtet hatte. Ein l-βLys-Analogon, l-β-Homolysin (l-βhLys), war bisher akzeptabel. Daher wurde l-βhLys-PEG-Azid (20) chemisch synthetisiert (Ergänzungstabelle 22) und in der rORF19-Reaktion verwendet. Wie erwartet vermittelte rORF19 das Kettenwachstum von l-βLys-Isopeptiden in Gegenwart von 20 (ergänzende Abbildung 6c und ergänzende Tabelle 23). Die Priming-Einheit 20 war aufgrund zweier Erkenntnisse wirksamer als 18: (i) die Produktivität der verlängerten Isopeptide wurde verbessert und (ii) Verbindung 20 wurde von rORF19 stärker verbraucht. Umgekehrt wurden l-αLys-PEG-Azid (22) (Ergänzungstabelle 24) und NH2-PEG-Azid (23) nicht als Priming-Einheiten akzeptiert (Ergänzungstabelle 6d, e). Aufgrund dieser Erkenntnisse wählten wir 20 als geeignete Priming-Einheit aus und bezeichneten das enzymatisch hergestellte Oligomer als ε-OβLm-PEG-Azid (21) (ergänzende Abbildung 6f).

Durch Erhöhen der rORF19-Konzentration von 0,1 auf 1,0 mg ml−1 produzierte die Reaktionsmischung 21 mit längeren Isopeptidketten (2–9-mer) (Ergänzungstabelle 25). Das resultierende Oligomer wurde aus der Reaktionsmischung gereinigt und dann erneut als Priming-Einheit verwendet. Diese Enzymreaktion der zweiten Runde ergab Oligomere, die länger waren (2–13 mer) (Ergänzungstabelle 25), die als anklickbare ε-OβLs für weitere Experimente verwendet wurden.

Verbindung 21 hatte Ketten mit viel kürzeren Längen als 8 (Ergänzungstabelle 7). Wir untersuchten daher zunächst den Zusammenhang zwischen der zellpenetrierenden Aktivität und der Peptidkettenlänge. Die 21 Oligomere wurden entsprechend der Kettenlänge (2, 3, 4, 5, 6 und 7–13 mer) gereinigt. Die sechs Oligomere mit unterschiedlichen Kettenlängen, 21 (2-mer), 21 (3-mer), 21 (4-mer), 21 (5-mer), 21 (6-mer) und 21 (7–13-mer), wurden dann jeweils gebildet durch Klick-Reaktion mit FAM konjugiert, wodurch ε-OβLm-FAM (24) (2-mer), 24 (3-mer), 24 (4-mer), 24 (5-mer), 24 (6-mer) und 24 (7–) entsteht 13 mer) (Ergänzungstabelle 26). HeLa-Zellen wurden mit 24 (50 µM) 60 Minuten lang bei 37 °C und 4 °C inkubiert. Die CM-Analyse zeigte keine zelldurchdringenden Aktivitäten in den kurzen Ketten (2-mer und 3-mer) (Abb. 7). Im Gegensatz dazu drangen die längeren Ketten (>4 mer) bei 37 °C und 4 °C in die Zellen ein und erreichten den Zellkern. Für die quantitative Analyse stellten wir 24 her, die nur aus zellpermeablen Isopeptiden (4–13 mer) bestanden (Ergänzungstabelle 27), und diese wurden bei 37 °C und 4 °C signifikant, schnell und dosisabhängig in Zellen internalisiert ( Ergänzende Abb. 7a–e). Während der Inkubation mit Endozytose-/Makropinozytose-Inhibitoren wurde die intrazelluläre Aufnahme von 24 (4–13 mer) nur durch EIPA unterdrückt (ergänzende Abbildung 7f). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Internalisierung von 2 durch direkte Penetration und Makropinozytose erfolgte. Interessanter ist, dass diese Ergebnisse darauf hindeuten, dass 2, eine Unterstruktur von STs, als CPP fungiert, um die ST-Kernstruktur (ST-F) in Zellen zu transportieren.

HeLa-Zellen wurden mit 50 µM ε-OβLm-FAM (24) (2 mer), 24 (3 mer), 24 (4 mer), 24 (5 mer), 24 (6 mer) oder 24 (7–) inkubiert. 13 mer) für 60 min bei 37 °C oder 4 °C unter typischen Zellkulturbedingungen mit Serum. Nach dem Waschen und Fixieren der Zellen wurde die zelluläre Lokalisierung (grün) von 24 mittels CM bestimmt. Die Zellmembran wurde mit Alexa594-WGA (rot) gefärbt. Die repräsentativen CM-Bilder werden angezeigt. Maßstabsbalken, 20 µm.

Wir haben mAG per Klickreaktion mit 21 (4–13-mer) konjugiert, um zu untersuchen, ob ε-OβL Makromoleküle intrazellulär abgeben kann (Ergänzungstabelle 28). Das resultierende Konjugat, ε-OβLm-mAG (25) (Abb. 2), wurde mit 50 µM zur HeLa-Zellkultur gegeben und 60 Minuten lang bei 37 °C oder 4 °C inkubiert. Interessanterweise wurden sowohl die diffusen als auch die vesikulären Signale von 25 in Zellen unter Inkubation bei 37 °C beobachtet (Abb. 8a). Bei der Inkubation bei 4 °C wurde 25 jedoch von der Zellmembran eingeschlossen und konnte kaum in die Zellen internalisiert werden (Abb. 8a, b). Diese Daten zeigten, dass 25 hauptsächlich durch Endozytose/Makropinozytose internalisiert wurde. Die folgenden Ergebnisse stützen dies ebenfalls: (i) die intrazelluläre Abgabe wurde durch PAO und EIPA erheblich unterdrückt (Abb. 8c) und (ii) 25 benötigten etwas mehr Zeit (~ 60 Minuten) (Abb. 8d) als 12, um in die Zellen einzudringen , während eine dosisabhängige Aufnahme von 25 bei 37 °C auftrat (Abb. 8e). Umgekehrt beobachteten wir gleichzeitig die Diffusionssignale in den mit 25 behandelten Zellen bei 37 ° C (Abb. 8a), was zeigt, dass 25 aus Endosomen freigesetzt und dann in das Zytosol diffundiert wurde (Abb. 2).

a Zytosolische Lieferungen von mAG konjugiert mit ε-OβL (2). HeLa-Zellen wurden mit mAG und ε-OβL-mAG (25) 60 Minuten lang bei 37 °C und 4 °C inkubiert. Die zelluläre Lokalisierung von 25 (grün) wurde durch CM nach dem Waschen und Fixieren der Zellen bestimmt. Die Zellmembran wurde mit Alexa594-WGA (rot) gefärbt. Es werden die repräsentativen CM-Bilder und die vergrößerten Ansichten der gelb umrandeten Bereiche angezeigt. Maßstabsbalken, 20 µm. b–e Relative zelluläre Aufnahme von 25 in HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden mit 50 µM (sofern nicht anders angegeben) mAG oder 25 inkubiert. mAG und 25 wurden mit Zellen 60 Minuten lang bei 37 °C (hellgrau) und 4 °C (weiß) inkubiert (b). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. *Signifikant bei p < 0,05 durch Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Protein 25 wurde mit Zellen 60 Minuten lang bei 37 °C im Kulturmedium inkubiert, das mit einem Endozytose-/Makropinozytose-Inhibitor (PAO, Dynasore, MDC oder EIPA) ergänzt war (c). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) dargestellt. **Signifikant bei p < 0,01 durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Protein 25 wurde mit Zellen 5–60 Minuten lang bei 37 °C (d) inkubiert, und 25 (3,1–50 µM) wurde 60 Minuten lang mit Zellen bei 37 °C (e) inkubiert.

Unsere Untersuchungen zeigten, dass die zelluläre Aufnahme von 1 und 2, die eine geringe Ladung hatten (z. B. FAM in dieser Studie), hauptsächlich durch energieunabhängige direkte Penetration erfolgte. Überraschenderweise wurden direkte Penetrationen auch in 12 (27 kDa) und 14 (25 kDa) beobachtet, während das kanonische CPP (R8) die Lieferung von Proteinladungen nur über Endozytose/Makropinozytose vermittelte. Wenn man bedenkt, dass 16 (38 kDa) seine Cre/loxP-Rekombination im Zellkern vermittelte und dass 17 (150 kDa) aus den Endosomen entwich und dann im Zellkern ankam, schließen wir, dass der Ansatz der polykationischen Konjugation mit 1 für beide auf den Zellkern gerichteten Proteine ​​wirksam ist Lieferung und die zytosolische Lieferung von Proteinladungen. Unsere vorliegende Studie ergab auch, dass die ε-OβL-Kette antibiotischer STs als CPP fungiert, um die ST-Kernstruktur (ST-F) in Zellen zu transportieren. Darüber hinaus stellten wir zu unserer Überraschung fest, dass die Konjugation mit 2 das endosomale Entweichen von Proteinladungen erleichterte. Obwohl wir in dieser Studie 21 (4–13-mer) verwendeten, könnte eine Verlängerung der Isopeptidkettenlänge das direkte Eindringen von Proteinladungen ermöglichen.

Die praktische intrazelluläre Abgabe biologischer Makromoleküle (Biopharmazeutika) würde therapeutische Ansätze dramatisch verändern und experimentelle Durchbrüche fördern, da sich zahlreiche potenzielle Wirkstoffziele (Zytokine, Wachstumsfaktoren und Signaltransduktionsproteine) im Zellinneren befinden44. CPPs gehören zu den vielversprechendsten Strategien, und die CPP-gesteuerte Technologie dreht sich derzeit um natürliche und synthetische Eupeptide. Als CPPs wurden Poly-l/d-Arginin13,14,15, Poly-l-Histidin45 und Poly-l/d-Lysin46 verwendet, die chemisch oder genetisch hergestellt wurden. Um die Lieferung von Proteinladungen durch diese Eupeptide zu ermöglichen, ist die rekombinante Expression von CPP-Frachtfusionen am N- oder C-Terminus eine einfache Strategie. Allerdings stellen geringe Expressionsniveaus in einem Wirtsstamm aufgrund der Unlöslichkeit, Toxizität und Verkürzung der Fusionsproteine ​​bekannte Probleme dar16,47. Im Gegensatz dazu ist die chemische In-vitro-Anbindung eines CPP an eine Proteinoberfläche ein vielversprechender alternativer Ansatz. Dieser Biokonjugationsprozess beruht auf der chemischen Synthese von CPPs, die häufig ein reaktives Gruppenende enthalten, das für funktionelle Gruppen (z. B. primäre Amin- und Sulfhydrylgruppen) auf der Proteinoberfläche spezifisch ist. Der resultierende CPP-Schwingarm am Proteinkörper ist jedoch aufgrund des proteolytischen Abbaus häufig biochemisch instabil48. Obwohl die zyklischen CPPs (z. B. zyklische Tat-Peptide und zyklische Oligoarginine) ein großes Potenzial zur Überwindung des kritischen Abbauproblems haben20,48,49, würde eine viel vielseitigere und einfachere Methode ohne aufwändige Synthese das Anwendungspotenzial der CPP-gesteuerten Technologie erweitern. Daher sind die natürlich vorkommenden polykationischen Isopeptide 1 und 2, die gegen Peptidasen/Proteinasen22 resistent und für Säugetierzellen ungiftig sind1,2,3, eine vielversprechende neue Klasse von CPPs. Darüber hinaus erwies sich ihre Biosynthesemaschinerie als nützliche Alternative für die Installation einer anklickbaren Gruppe an den C-Termini der polykationischen Isopeptide.

Die Mechanismen der herausragenden zelldurchdringenden Aktivitäten von 1 und 2 sind wie bei den kanonischen CPPs noch unklar. Allerdings wurden die mit 1 oder 2 konjugierten Proteinladungen sicherlich durch direktes Eindringen unter Bedingungen hoher Konzentration (50 μM) in die Zellen internalisiert. Jüngste Studien haben sich auf rational gestaltete synthetische CPPs konzentriert, um effizientere Internalisierungen (direkte Penetration oder endosomale Flucht) mit Behandlungen in niedriger Konzentration (~2 μM) zu erreichen und Resistenz gegen proteolytischen Abbau zu verleihen19,20,21,48,49,50,51. Gleichzeitig können diese Versuche die Menge an synthetischen CPPs reduzieren, die durch fortgeschrittene chemische Synthese mit hohen Kosten hergestellt werden. Im Gegensatz dazu ermöglicht eine kostengünstige Strategie die Durchführung intrazellulärer Proteinlieferungen unter hohen Konzentrationsbedingungen (z. B. >50 μM), die für eine zuverlässige direkte Penetrationsaufnahme vorzuziehen sind. Die bakteriellen polykationischen Isopeptide 1 und 2 sind faszinierende neue Werkzeuge mit diesem Potenzial. Angesichts des Nachweises dieser zellpenetrierenden Aktivitäten schlagen wir für 1 und 2 den Namen polykationische Isopeptide, die in Zellen eindringen (PIECEs), vor. Obwohl es sich um die ersten Beispiele bakterieller PIECEs handelt, sind weitere Untersuchungen der zellpenetrierenden Aktivitäten in bakteriellen polykationischen Isopeptiden, wie z als γ-Poly-l/d-diaminobuttersäure4,5, β-poly-l-diaminopropionsäure6, ε-poly-l-β-lysin7, Cyanophycin9,10 und Multi-l-diaminopropionyl-poly-l-diaminopropionsäure (Ergänzende Abbildung 1a)11 würde die möglichen Anwendungen der CPP-gesteuerten Technologie erweitern.

Kurzkettige Polyole, 2-Propin-1-ol, 3-Buten-1-ol, Tetraethylenglykol (PEG), Triethylenglykolmono(2-propinyl)ether (PEG-Alkin), 11-Azido-3,6, 9-Trioxaundecanol (PEG-Azid) und 11-Azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amin (NH2-PEG-Azid) wurden von Tokyo Chemical Industry (Japan) gekauft. β-hLys wurde von Watanabe Chemical (Japan) gekauft. DBCO-PEG4-5/6-FAM wurde von Jena Bioscience (Deutschland) bezogen. DBCO-Sulfo-N-hydroxysuccinimidylester (DBCO-Sulfo-NHS) wurde von BROADPHARM (USA) bezogen. Der FAM-NHS-Ester wurde von ANASPEC (USA) bezogen. R8-Azid (9) und R8-FAM (11) wurden von Eurofins Genomics (Japan) bezogen. Die Endozytose-/Makropinozytose-Inhibitoren, d. h. Phenylarsinoxid (PAO), Dynasore, Monodansylcadaverin (MDC) und Ethylisopropylamilorid (EIPA), wurden von Fujifilm Wako Pure Chemical (Japan), Adipogen Life Sciences (USA), Sigma-Aldrich ( USA) bzw. TOCRIS Bioscience (USA). Alle anderen verwendeten Chemikalien waren von analytischer Qualität.

S. albulus NBRC14147 wurde zur Herstellung von ε-PαL und seinen Esterderivaten verwendet. E. coli BL21(DE3) wurde zur Überexpression von mAG-, mKO- und Cre-Rekombinase verwendet. Menschliche Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa), menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293T), menschliche hepatozelluläre Karzinomzellen (HepG2) und menschliche akute myeloische Leukämiezellen (K562) wurden vom RIKEN BioResource Research Center (Japan) erworben. Humane Neuroblastomzellen (SH-SY5Y) und humane dermale Fibroblastenzellen (HDF) wurden von der American Type Culture Collection (USA) bzw. PromCell (Deutschland) erworben. Die vom RIKEN BioResource Research Center (Japan) authentifizierten Zelllinien (HeLa, HEK293T, HepG2, K562) wurden nicht weiter validiert. Die Zelllinien SH-SY5Y und HDF wurden nicht authentifiziert. Wir haben die Zelllinien (HeLa, HEK293T, HepG2, K562) gekauft, die vom RIKEN BioResource Research Center (Japan) auf Mykoplasmenkontamination getestet wurden, SH-SY5Y und HDF wurden jedoch nicht auf Mykoplasmenkontamination getestet.

Zwei Plasmide, pmAG1-S1 und pmKO1-MC1 (MBL, Japan), wurden als PCR-Vorlagen zur Amplifikation der mAG- und mKO-Gene verwendet, und das Plasmid pmKO1-MC1 wurde auch zur Konstruktion des Cre-Aktivitätsreporterplasmids verwendet. pKU470 (ein Geschenk von Dr. Haruo Ikeda)52 wurde als PCR-Matrize zur Amplifikation des Cre-Rekombinase-Gens verwendet.

S. albulus NBRC14147 wurde 1 Tag lang bei 28 °C in M3G-Medium53 gezüchtet. Wenn der pH-Wert der Kulturbrühe etwa 4 erreichte, wurden 0,2 % (Gew./Vol.) des kurzkettigen Polyols (Glycerin, 2-Propin-1-ol, 3-Buten-1-ol, PEG, PEG-Alkin usw.) hinzugefügt Dem Kulturmedium wurde PEG-Azid zugesetzt. Nach zweitägiger Kultivierung bei 28 °C wurde das resultierende ε-PαL-Ester-Derivat in der Kulturbrühe mittels HPLC-HR-ESI-MS analysiert (siehe unten).

Die ε-PαL-Ester-Derivate wurden aus der Kulturbrühe (1000 ml) mithilfe der Ionenkomplexbildung wie in unserer vorherigen Studie54 beschrieben gereinigt und anschließend durch präparative HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Sunniest RP-AQUA, 5 µm, 10,0) weiter gereinigt × 250 mm; ChromaNik Technologies, Japan) bei 35 °C bei einer Durchflussrate von 7 ml/min und mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in Wasser in 0,1 % (V/V) HFBA, laufen über 30 Minuten (20–50 %). [v/v] Acetonitril für 30 Min.). Die Fraktionen wurden gesammelt und mit einem Ultraviolettdetektor (UV) bei 210 nm überwacht. Die Fraktion, die die gereinigten ε-PαL-Ester-Derivate enthielt, wurde lyophilisiert, um ein weißes Pulver (ungefähr 300 mg) zu ergeben. Die Mengen an ε-PαL und den im Überstand produzierten ε-PαL-Esterderivaten wurden gemäß der von Itzhaki55 beschriebenen Methode bestimmt.

Mit der in unserer vorherigen Studie56 beschriebenen Methode wurde das rekombinante Pls (rPls) aus einem überexprimierenden Streptomyces-Stamm gereinigt. Wir führten Enzymreaktionen mit Glycerin und PEG durch, um festzustellen, ob die ε-PαL-Ester-Derivate von Pls produziert wurden. Die Reaktionsmischung enthält 100 mM N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure (TAPS)-NaOH (pH 8,5), 1 mM l-αLys, 5 mM MgCl2, 5 mM ATP, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 20 % (Gew./Vol.) Glycerin, 0,2 % (Gew./Vol.) NP-40 und 300 µg ml−1 rPls wurden mit und ohne 1 % (Gew./Vol.) PEG 10 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Das Reaktionsgemisch, das ε-PαL-Glycerin (3) oder ε-PαL-PEG (6) enthielt, wurde dann mittels HPLC-HR-ESI-MS analysiert (siehe unten).

Die folgenden drei Sätze von PCR-Primern (Ergänzungstabelle 29) wurden entworfen und zur Amplifikation der mAG-, mKO- und Cre-Rekombinase-Gene verwendet: pET21a_mAG-F und pET21a_mAG-R für die Konstruktion von rekombinantem mAG; pET21a_mKO-F und pET21a_mKO-R für die Konstruktion von rekombinantem mKO; und pET21a_Cre-F und pET21a_Cre-R für die Konstruktion rekombinanter Cre-Rekombinase. Die PCR-Produkte wurden mit dem Expressionsvektor pET21a (Novagen, USA) ligiert. Nach Bestätigung ihrer DNA-Sequenzen wurden die resultierenden Plasmide zur Expression als C-terminal 6×His-markierte Fusionsproteine ​​in E. coli BL21(DE3) eingeführt. Die rekombinanten Proteine ​​(Enzyme) wurden unter Verwendung von Standardprotokollen mit Nickel-Nitriloessigsäure (Ni-NTA)-Sepharose (Qiagen) gereinigt und dann für weitere Experimente verwendet.

ε-PαL-FAM (10): ε-PαL-PEG-Azid (8, 25 µmol) wurde zu 50 ml 80 % (v/v) DMSO gegeben. Als nächstes wurde DBCO-PEG4-5/6-FAM (27,5 µmol) zugegeben und die Mischung 3 Stunden lang bei 25 °C gerührt. ε-PαL-FAM (10) im Reaktionsgemisch wurde durch HPLC-HR-ESI-MS analysiert und anschließend durch präparative HPLC wie oben beschrieben gereinigt. Die Fraktionen wurden gesammelt und mit einem Ultraviolettdetektor (UV) bei 254 nm überwacht. Die das gereinigte 10 enthaltende Fraktion wurde lyophilisiert, um ein gelbes Pulver (ungefähr 50 mg) zu ergeben.

ε-PαL-mAG (12), ε-PαL-mKO (14) und ε-PαL-Cre (16): Die rekombinanten Proteine ​​(Enzyme) (5 µmol) wurden zusammen mit 50 ml 100 mM NaHCO3 hinzugefügt DBCO-Sulfo-NHS-Ester (10 µmol). Nach 4-stündigem Rühren bei 4 °C wurden die Reaktionsmischungen mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert und 8 (5,5 µmol) zu 50 ml der dialysierten Lösung gegeben und 4 Stunden bei 4 °C gerührt . Zusätzlich wurden 12 und 14 durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer HiTrap SP HP-Säule (Cytiva) auf dem AKTA-System (GE Healthcare) weiter gereinigt, nachdem die Produktion von 12, 14 und 16 durch HPLC-HR-ESI-MS-Analyse bestätigt wurde (siehe unten). Als Eluenten wurden Puffer A (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0) und Puffer B (2 M NaCl und 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0) verwendet. Flussrate: 3 ml min−1; Gradient: 0–20 Säulenvolumen (CV) (B, 10–75 %), 20–30 CV (B, 100 %). Die Fraktionen wurden gesammelt und mit einem UV-Detektor bei 280 nm überwacht. Die Fraktionen mit den gereinigten Proteinen wurden durch Ultrafiltration (Vivaspin 6; Cytiva) konzentriert und anschließend für weitere Experimente verwendet. ε-PαL-Cre (16) wurde für weitere Experimente ohne Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie verwendet.

R8-mAG (13) und R8-mKO (15): Das rekombinante mAG und mKO (0,5 µmol) wurden zusammen mit DBCO-Sulfo-NHS-Ester (1 µmol) zu 5 ml 100 mM NaHCO3 gegeben. Nach 4-stündigem Rühren bei 4 °C wurden die Reaktionsmischungen mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert und R8-Azid (9, 0,55 µmol) zu 5 ml der dialysierten Lösung gegeben und 4 Stunden lang gerührt h bei 4 °C. Die resultierenden Konjugate 13 und 15 wurden durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer HiTrap SP HP-Säule (Cytiva) auf dem AKTA-System (GE Healthcare) wie oben beschrieben weiter gereinigt, nachdem die Produktion von 13 und 15 durch HPLC-HR bestätigt wurde. ESI-MS-Analyse (siehe unten). Die 13 und 15 enthaltenden Fraktionen wurden durch Ultrafiltration (Vivaspin 6) konzentriert und dann für weitere Experimente verwendet.

Das synthetische DNA-Fragment, das zwei loxP-Sequenzen, ein TGA-Stoppcodon und das Ampicillin-Resistenzgen (Ampr-Gen) (Ergänzungstabelle 30) trägt, wurde mit durch Bam HI und Eco RI verdautes pmKO1-MC1 ligiert. Das resultierende Plasmid, pmKO_loxP, wurde mit Eco RI und Hind III verdaut und mit dem durch die PCR-Primer (pmKO1_mAG-F und pmKO1_mAG-R, Ergänzungstabelle 29) amplifizierten mAG-Genfragment ligiert, um das Cre-Aktivitätsreporterplasmid (pmKO_loxP_mAG) zu ergeben.

Anti-α-Tubulin-Antikörper (mAb, 1 µmol) (Fujifilm Wako Pure Chemical, Japan) wurde zusammen mit FAM-NHS-Ester (4 µmol) zu 10 ml 100 mM NaHCO3 gegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei 37 °C wurde DBCO-Sulfo-NHS-Ester (4 µmol) zum Reaktionsgemisch gegeben und 30 Minuten bei 37 °C gerührt. Die Reaktionsmischungen wurden mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert, und 8 (2 µmol) wurde zu 10 ml der dialysierten Lösung gegeben und 4 Stunden lang bei 4 °C gerührt. Darüber hinaus wurde 17 im Reaktionsgemisch durch Ultrafiltration (Vivaspin 6) konzentriert und für weitere Experimente verwendet, nachdem die Produktion von 17 durch HPLC-HR-ESI-MS-Analyse bestätigt wurde.

Zelllinien wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 gezüchtet. Die Zelllinien und entsprechenden Medien waren wie folgt: HeLa, Dulbeccos modifiziertes Eagles-Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS); HEK293T, DMEM mit 10 % FBS; HepG2, DMEM mit 10 % FBS; HDF, DMEM mit 10 % FBS; SH-SY5Y, DMEM/Ham's F-12 mit 10 % FBS; und K562, RPMI1640 mit 10 % FBS. Alle Medien enthalten 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin.

Die Zellen wurden in jede Vertiefung eines Objektträgerglases mit 8 Vertiefungen (Matsunami, Japan) ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert. Ein frisches Medium mit einer Probe (10–17, 24 oder 25) wurde zu den Zellen gegeben und dann 60 Minuten oder 120 Minuten lang bei 4 °C oder 37 °C inkubiert, nachdem die Zellen mit dem Medium gewaschen wurden. Anschließend wurden die Zellen mit PBS, 100 µg ml-1 Heparin in PBS und dann noch zweimal mit PBS gewaschen. Wir fügten 4 % Paraformaldehyd in PBS hinzu, um die Zellen zu fixieren, und inkubierten sie 30 Minuten lang bei 25 °C. 5 µg ml-1 Weizenkeimagglutinin (WGA)/Alexa594 (oder Alexa488) in PBS wurden hinzugefügt und 10 Minuten bei 25 °C inkubiert, um die Zellmembran nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBS anzufärben. Anschließend wurden die Zellen mit ProLongTM Gold Antifade-Reagenz mit DAPI (Invitrogen, USA) behandelt. Die Zellen wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop LSM 900 (ZEISS) beobachtet.

HeLa-Zellen wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen (Falcon) ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 ° C in DMEM mit 10 % FBS inkubiert. Als nächstes wurde ein frisches Medium mit einer Probe (10–12, 24 oder 25) zu den Zellen gegeben und dann 5–60 Minuten bei 4 °C oder 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, gefolgt von 100 µg ml-1 Heparin in PBS und dann zweimal mit PBS. Zur Zelllyse wurden den Zellen 300 μl Lysepuffer (1 % Triton X-100 in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0) zugesetzt. Die resultierenden Zelllysate wurden 30 Minuten lang zentrifugiert (21.500 × g bei 4 °C) und die Fluoreszenz (485 ex/535 em) der Überstände wurde mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät (SpectraMax iD3; Molecular Devices oder SYNERGY 4; BioTek) gemessen ).

In den Tests mit Endozytose-/Makropinozytose-Inhibitoren wurden der Zellkultur 1 µM PAO, 100 µM MDC, 100 µM Dynasore oder 100 µM EIPA zugesetzt.

HeLa-Zellen wurden in einer 35-mm-Glasbodenschale (Matsunami, Japan) ausgesät und in DMEM mit 10 % FBS 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Als nächstes wurde ein frisch erwärmtes (37 °C) Medium mit 50 µM ε-PαL-mAG (12) oder R8-mKO (15) hinzugefügt und die Zeitrafferbilder der Zellen wurden 30 Minuten lang alle 1 Minute aufgenommen durch ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop LSM 900 (ZEISS).

HeLa-Zellen wurden in einer 35-mm-Glasbodenschale (Matsunami, Japan) ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 ° C in DMEM mit 10 % FBS inkubiert. Als nächstes wurde ein frisches Medium mit 50 µM ε-PαL-mAG (12) oder R8-mKO (15) hinzugefügt und die Zellen wurden 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, gefolgt von 100 µg ml-1 Heparin in PBS und dann noch zweimal mit PBS. Abschließend wurde frisches DMEM mit 10 % FBS hinzugefügt und bei 37 °C inkubiert. Die Zeitrafferbilder wurden 12 Stunden lang alle 10 Minuten mit optischer Schnittmikroskopie (All-in-One-Fluoreszenzmikroskop BZ-X810; KEYENCE) aufgenommen, um 12 oder 15 nach der Zellaufnahme zu verfolgen.

HEK293T-Zellen wurden mit dem Plasmid pmKO_loxP_mAG unter Verwendung von FuGENE Transfection (Promega) gemäß den Angaben des Herstellers transfiziert. Die Zellen wurden mit DMEM-Medium gewaschen und dann 60 Minuten lang bei 37 °C mit 50 µM ε-PαL-Cre (16) behandelt. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, gefolgt von 100 µg ml-1 Heparin in PBS und dann noch zweimal mit PBS. Abschließend wurde frisches DMEM mit 10 % FBS hinzugefügt und 24 Stunden bei 37 °C inkubiert, um ein fluoreszierendes Protein zu exprimieren. Die Live-Cell-Bildgebung wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (Leica DMi8) erfasst.

N,N-Bis(tert-butoxycarbonyl)-l-β-Lysin [(Boc)2-l-βLys; 1,5 mmol]·DCHA, das wie in der Ergänzenden Anmerkung beschrieben nach den zuvor beschriebenen Methoden57 synthetisiert worden war, wurde mit AcOEt/10 % Zitronensäure säureextrahiert, um DCHA zu entfernen. NH2-PEG-Azid (0,55 mmol) und DMT-MM (1,5 mmol) wurden zu einer MeOH-Lösung (10 ml) des freien (Boc)2-l-βLys gegeben und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Rückstand wurde in Et2O (10 ml) gelöst, mit Salzlösung gewaschen und nach einer Konzentration im Vakuum getrocknet (Na2SO4). Ein so durch Eindampfen erhaltenes rohes (Boc)2-l-βLys-PEG-azid wurde zu 4 N HCl/AcOEt (20 ml) gegeben und die Mischung 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Eindampfen wurde das im Gemisch verbliebene HCl durch azeotropes Eindampfen mit Toluol/MeOH weiter entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und lyophilisiert, was l-βLys-PEG-azid (18)·HCl als farbloses Öl ergab (22 % Ausbeute, 2 Schritte). l-βhLys-PEG-Azid (20)·HCl (38 % Ausbeute) und l-αLys-PEG-Azid (22)·HCl (81 % Ausbeute) wurden aus l-βhLys bzw. l-αLys durch Bis synthetisiert -Boc-Derivatisierung, Kondensation mit NH2-PEG-Azid und anschließende Entschützung. Ihre NMR-Daten sind in den Ergänzungstabellen 19, 21 und 23 zusammengefasst.

Gemäß der in unserer vorherigen Studie3 beschriebenen Methode wurde der rekombinante ORF19 (rORF19) aus einem überexprimierenden E. coli-Stamm gereinigt. Eine Reaktionsmischung (100 μl), bestehend aus 50 mM TAPS (pH 9,0), 18 % (v/v) Glycerin, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM l-βLys, 1 mM Akzeptorsubstrat (18, 20 oder 22) und 0,1 mg ml−1 rORF19 wurden 1 Stunde lang bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 5-minütiges Erhitzen auf 100 °C gequencht, die Mischung zentrifugiert und der Überstand mittels HPLC-HR-ESI-MS analysiert (siehe unten).

Eine Reaktionsmischung (20 ml), bestehend aus 50 mM TAPS (pH 9,0), 18 % (v/v) Glycerin, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM l-βLys, 1 mM 20 und 1 mg ml−1 rORF19 wurde über Nacht bei 30 ° C inkubiert (Enzymreaktion der ersten Runde, Ergänzungstabelle 25). Das resultierende ε-OβLm-PEG-Azid (21) wurde mit einer Einweg-Ionenaustauschsäule (InertSep MC-2-Säule; GL Science, Japan) gereinigt. Die Mischung (20 ml) wurde zu 80 ml 20 % (v/v) wässrigem Methanol gegeben und auf eine Säule mit InertSep MC-2 (Na+-Form; 1 g: äquilibriert mit 20 % (v/v) wässrigem Methanol) aufgetragen. nachdem der pH-Wert der Reaktionsmischung mit HCl auf 7 eingestellt wurde. Das Produkt (kurzkettiges 21, 2–9-mer) wurde mit 10 ml 1 M NH4OH eluiert, nachdem die Säule mit 50 ml 20 % (v/v) wässrigem Methanol gewaschen worden war. Die Elutionsfraktion wurde lyophilisiert und dann als Akzeptorsubstrat für die Enzymreaktion der zweiten Runde verwendet. Das Enzymreaktionsgemisch der zweiten Runde (20 ml), bestehend aus 50 mM TAPS (pH 9,0), 18 % (v/v) Glycerin, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 5 mM l-βLys, 1 mM kurzkettiges 21 ( 2–9 mer) und 1 mg ml-1 rORF19 wurden über Nacht bei 30 ° C inkubiert (Ergänzungstabelle 25). Das Reaktionsprodukt, das langkettige 21 (2–13-mer), wurde mit InertSep MC-2 gereinigt und anschließend durch präparative HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Sunniest RP-AQUA: 5 µm, 10,0 × 250 mm; ChromaNik) weiter gereinigt Technologies, Japan) bei 40 °C bei einer Durchflussrate von 7 ml/min und mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in Wasser in 0,1 % (v/v) HFBA, Lauf über 36 min [20–38 % (v/v) Acetonitril für 36 Min.]. Die Fraktionen wurden gesammelt und mit einem Ultraviolettdetektor (UV) bei 210 nm überwacht. Die das gereinigte 21 enthaltende Fraktion wurde lyophilisiert und für weitere Experimente verwendet.

ε-OβLm-FAM (24) und ε-OβLm-mAG (25) wurden nach dem gleichen Verfahren synthetisiert, das für die Synthese von 10 und 12 verwendet wurde (siehe oben).

ε-PαL (1), ε-PαL-Glycerin (3), ε-PαL-Alkin (4), ε-PαL-Alken (5), ε-PαL-PEG (6), ε-PαL-PEG-Alkin (7), ε-PαL-PEG-Azid (8) und ε-PαL-FAM (10) wurden mittels HPLC-HR-ESI-MS (maXis plus; Bruker) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (SunShell HFC18–) analysiert. 16: 2,6 µm, 2,1 × 150 mm; ChromaNik Technologies, Japan) bei 40 °C bei einer Flussrate von 0,3 ml min−1 und mit einem dreistufigen linearen Gradienten von Acetonitril (ACN) in Wasser in 0,1 % (v/ v) Heptafluorbuttersäure (HFBA) (Fujifilm Wako Pure Chemical, Japan) über 30 Minuten laufen lassen [10–25 % (V/V) ACN für 5 Minuten, 25–60 % (V/V) ACN für 17 Minuten, 60– 95 % (v/v) ACN für 5 Min. und 95–95 % (v/v) ACN für 3 Min.].

ε-PαL-mAG (12), R8-mAG (13), ε-PαL-mKO (14), R8-mKO (15) und ε-PαL-Cre (16) wurden mittels HPLC-HR-ESI analysiert. MS (maXis plus) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Sunshell C8-30HT: 3,4 µm, 2,1 × 150 mm; ChromaNik Technologies) bei 70 °C bei einer Flussrate von 0,3 ml min−1 und mit einem linearen Gradienten von ACN in Wasser in 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure (TFA), 30 Minuten lang laufen lassen [12 und 13, 31–37 % (v/v) ACN für 30 Minuten; 14 und 15, 2–90 % (v/v) ACN für 30 Minuten; 16, 20–70 % (v/v) ACN für 30 Min.].

l-βLys-PEG-Azid (18), l-βhLys-PEG-Azid (20) und l-αLys-PEG-Azid (22) wurden durch HPLC-HR-ESI-MS (maXis plus) unter Verwendung einer umgekehrten Analyse analysiert -Phasensäule (SunShell HFC18-16: 2,6 µm, 2,1 × 150 mm; ChromaNik Technologies, Japan) bei 40 °C bei einer Flussrate von 0,3 ml min−1 und mit einem dreistufigen linearen Gradienten von ACN in Wasser in 0,1 % (v/v) HFBA über 30 Min. laufen lassen (5–25 % [v/v] ACN für 5 Min., 25–35 % [v/v] ACN für 17 Min., 35–95 % [v/v] ACN für 5 Minuten und 95–95 % [v/v] ACN für 3 Minuten).

1H- und 13C-NMR-Spektren wurden bei 600 bzw. 150 MHz mit einem JNM-ECA 600 NMR (JEOL) aufgenommen. Ein- und zweidimensionale Experimente (Doppelquanten-Filterkorrelationsspektroskopie [DQF-COSY] und zeitkonstante heteronukleare Mehrbindungskonnektivität [CT-HMBC]) wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die Proben wurden in D2O gelöst.

Alle statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software (Version 8; GraphPad, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn der berechnete p-Wert < 0,05 war. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statischen Methoden verwendet. Sofern statische Analysen durchgeführt wurden, sind die Stichprobengrößen in den entsprechenden Abbildungslegenden aufgeführt. Alle im Manuskript dargestellten Experimente waren reproduzierbar. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (sd) (n = 3) dargestellt. Informationen zur Anzahl der biologischen und technischen Replikate werden für einzelne Experimente in den Legenden der Abbildungen angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Daten sind in den Hauptabbildungen und Ergänzungsabbildungen verfügbar. Rohdaten für Abb. 3c – j, 4b – g, 8b – e, ergänzende Abb. 7a – f und ergänzende Tabelle 19 sind in den ergänzenden Daten 1–5 verfügbar. Das in dieser Studie konstruierte Plasmid pmKO_loxP_mAG wurde im Addgene unter der ID-Nummer 192857 hinterlegt.

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Referenzen herunterladen

Diese Forschung wurde durch ein JSPS KAKENHI-Stipendium für wissenschaftliche Forschung in innovativen Bereichen 16H06445 (YH), ​​durch das JSPS A3 Foresight Program, durch die JSPS KAKENHI-Stipendien 16H03284 (YH) und 20H02918 (YH) sowie durch die Japan Foundation for Applied Enzymology (YH) unterstützt ), der Nagase Science and Technology Foundation (YH) und der Amano Enzyme Foundation (YH). Wir danken H. Fujino für die Diskussion über die Zellkultur.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yamato Takeuchi, Kazunori Ushimaru, Kohei Kaneda.

Graduiertenschule für Biowissenschaften und Biotechnologie, Präfekturuniversität Fukui, Eiheiji-cho, Fukui, 910-1195, Japan

Yamato Takeuchi, Kazunori Ushimaru, Kohei Kaneda, Chitose Maruyama, Takashi Ito, Hajime Katano und Yoshimitsu Hamano

Forschungsinstitut für nachhaltige Chemie, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Ibaraki, 305-8565, Japan

Kazunori Ushimaru

Fukui Bio Incubation Center (FBIC), Präfekturuniversität Fukui, Eiheiji-cho, Fukui, 910-1195, Japan

Chitose Maruyama, Takashi Ito und Yoshimitsu Hamano

MicrobeChem Inc., Eiheiji-cho, Fukui, 910-1195, Japan

Chitose Maruyama und Yoshimitsu Hamano

Abteilung für Biowissenschaften und Technologie, Kansai-Universität, Suita, Osaka, 564-8680, Japan

Kazuya Yamanaka

Graduate School of Engineering, Universität Hokkaido, Kita-ku, Sapporo, Hokkaido, 060-8628, Japan

Yasushi Ogasawara und Tohru Dairi

Abteilung für Biotechnologie, Präfekturuniversität Toyama, Imizu-shi, Toyama, 939-0398, Japan

Yasuo Kato

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YH konzipierte und gestaltete das Projekt. YT, KU und KY führten Experimente durch und sammelten Daten zu ε-PαL. HK entwickelte Protokolle zur Reinigung von ε-PαL-Ester-Derivaten. KK und CM führten Experimente durch und sammelten Daten zu ε-OβL. TI diskutierte und interpretierte Ergebnisse aus Zellkulturen. CM, YO und TD analysierten die Verbindungen und klärten ihre chemischen Strukturen auf. YK synthetisierte L-βLys. YH hat das Manuskript geschrieben und alle anderen Autoren haben es überprüft und kommentiert.

Korrespondenz mit Yoshimitsu Hamano.

YH und KU sind Miterfinder einer Patentanmeldung (PCT/JP2018/031153), die von der Präfekturuniversität Fukui im ​​Zusammenhang mit der Arbeit an diesem Manuskript eingereicht wurde. YH und CM sind Mitbegründer von MicrobeChem Inc. Die übrigen Autoren geben an, keine konkurrierenden Interessen zu haben.

Communications Biology dankt Rakesh Tiwari, Ole Tietz und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Zhijuan Qiu. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Takeuchi, Y., Ushimaru, K., Kaneda, K. et al. Erster direkter Beweis für das direkte Eindringen polykationischer Homopoly(aminosäuren), die von Bakterien produziert werden, in die Zellmembran. Commun Biol 5, 1132 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04110-4

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Eingegangen: 03. Juni 2022

Angenommen: 13. Oktober 2022

Veröffentlicht: 26. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04110-4

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