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Jul 05, 2023

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Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 24794 (2016) Diesen Artikel zitieren 9893 Zugriffe 22 Zitate 78 Altmetric Metrics-Details Firefly-Luciferin, das Substrat für die Biolumineszenzreaktion von

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 24794 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Firefly-Luciferin, das Substrat für die Biolumineszenzreaktion leuchtender Käfer, besitzt einen Benzothiazolring, der in der Natur selten vorkommt. Hier demonstrieren wir eine neuartige Eintopfreaktion zur Herstellung von Glühwürmchen-Luciferin in einem neutralen Puffer aus p-Benzochinon und Cystein ohne synthetische Reagenzien oder Enzyme. Die Bildung von Glühwürmchen-Luciferin war in verschiedenen neutralen Puffern in geringer Ausbeute, während sie in sauren oder basischen Puffern, in organischen Lösungsmitteln oder unter einer Stickstoffatmosphäre gehemmt oder vollständig verhindert wurde. Die Markierungsanalyse des Glühwürmchen-Luciferins mit stabilen Isotopen-Cysteinen zeigte, dass der Benzothiazol-Ring durch Decarboxylierung und Kohlenstoff-Schwefel-Bindungsumlagerung von Cystein gebildet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biosynthese von Glühwürmchen-Luciferin aus der nicht-enzymatischen Produktion von Glühwürmchen-Luciferin unter Verwendung gemeinsamer primärer Biosyntheseeinheiten, p-Benzochinon und Cystein, entwickelt/entwickelt werden kann.

Glühwürmchen-Luciferin (D-Glühwürmchen-Luciferin) ist das Substrat, das üblicherweise für die Biolumineszenzreaktion von Leuchtkäfern, Glühwürmchen (Familie Lampyridae), Eisenbahnwürmern (Phengodidae) und Feuerkäfern (Elateridae)1 verwendet wird. Diese Reaktion wird durch Glühwürmchen-Luciferase in Gegenwart von ATP, Mg2+ und molekularem Sauerstoff1 katalysiert. Dieses Lumineszenzsystem wird in allen Bereichen der Biowissenschaften häufig eingesetzt, beispielsweise für die Echtzeit-Bildgebung der Genexpression2.

Natürliches Glühwürmchen-Luciferin wurde aus den Laternen des nordamerikanischen Glühwürmchens Photinus pyralis3 isoliert und die chemische Struktur wurde als (S)-2-(6′-Hydroxy-2′-benzothiazolyl)-2-thiazolin-4-carbonsäure bestimmt chemische Synthese4,5. Das (R)-Enantiomer (L-Glühwürmchen-Luciferin) ist für die Biolumineszenzreaktion inaktiv6,7. Obwohl der Benzothiazolring ein gemeinsames Gerüst ist, das in einer Vielzahl biologisch und pharmakologisch aktiver Verbindungen vorkommt8, kommt er in der Natur relativ selten vor9. Aus diesem Grund konzentrierten sich die Forschungsanstrengungen nicht nur auf die Entwicklung chemischer Synthesemethoden, sondern auch auf die Aufklärung biosynthetischer Prozesse von Benzothiazolverbindungen10,11,12.

McCapra und Razavi berichteten über die chemische Synthese von Ethyl-6-hydroxybenzothiazol-2-carboxylat aus p-Benzochinon und Cysteinethylesterhydrochlorid in drei Schritten und schlugen vor, dass Glühwürmchen-Luciferin in der Natur aus p-Benzochinon und Cystein biosynthetisiert wird13. Wir haben kürzlich gezeigt, dass D-Glühwürmchen-Luciferin aus einem Molekül Hydrochinon/p-Benzochinon und zwei Molekülen L-Cystein biosynthetisiert werden kann, indem stabile isotopenmarkierte Verbindungen in die erwachsene Laterne eines lebenden japanischen Glühwürmchens, Luciola lateralis, injiziert werden14. Wir haben auch gezeigt, dass die Bildung des Benzothiazolrings mit der Decarboxylierung von L-Cystein einhergeht14. Die Einzelheiten des Biosyntheseprozesses von Glühwürmchen-Luciferin, einschließlich der Zwischenprodukte und des Umlagerungsmechanismus für die Bildung des Benzothiazol-Rings, blieben jedoch unklar.

Das Studium der Chemie in wässriger Lösung kann wertvolle Einblicke in die Syntheseprozesse natürlicher Produkte in der Natur liefern, da Enzyme in wässriger Lösung arbeiten15. Vilotijevic und Jamison zeigten beispielsweise, dass in neutralem Wasser Epoxidöffnungskaskaden auftreten, was Nakanishis Hypothese für die Biosynthese von Leiterpolyethern stützt, die in verschiedenen marinen Naturstoffen vorkommen16. Chapman et al. berichteten über die biomimetische Synthese des natürlichen Pflanzenprodukts Carpanon aus zwei Carpacinmolekülen unter Verwendung von Pd(II) in wässriger methanolischer Lösung17,18. Robinson berichtete über die Eintopfsynthese von Tropinon aus Succindialdehyd, Methylamin und Acetondicarbonsäure in neutraler wässriger Lösung19. Spätere Studien ergaben, dass die Robinson-Synthese die Biosynthese von Tropinon nachahmt20. Auch die chemische Synthese in Wasser hat in letzter Zeit als eines der Prinzipien der „grünen Chemie“ große Aufmerksamkeit erregt21 und es gibt zahlreiche Berichte über die erfolgreiche Synthese verschiedener bioaktiver Verbindungen auf der Grundlage dieses Konzepts22.

In dieser Studie demonstrieren wir eine neuartige Eintopfreaktion zur Herstellung von Glühwürmchen-Luciferin in einem neutralen Puffer aus p-Benzochinon und Cystein ohne synthetische Reagenzien oder Enzyme. Wir zeigen auch, dass der Benzothiazolring des Glühwürmchen-Luciferins durch Decarboxylierung und Kohlenstoff-Schwefel-Umlagerung von Cystein in der Eintopfreaktion gebildet wird.

Mittels HPLC mit einem UV-sichtbaren Detektor fanden wir in der Reaktionsmischung aus p-Benzochinon und L-Cystein (1:1) in Tris-HCl (pH 7,5) ein Produkt, das authentischem Glühwürmchen-Luciferin entspricht (Abb. 1b,c). . Das Produkt wurde durch NMR-Analyse als Firefly-Luciferin identifiziert (ergänzende Abbildung S1 und Tabelle S1).

Bildung von Glühwürmchen-Luciferin aus p-Benzochinon und L-Cystein.

(a) Schema für die Reaktion von p-Benzochinon mit L-Cystein zu L-Glühwürmchen-Luciferin unter verschiedenen neutralen Pufferbedingungen. (b) HPLC-Analyse der Produkte, die durch die Reaktion von p-Benzochinon mit L-Cystein in 90 mM Tris-HCl (pH 7,5) unter Verwendung eines Fluoreszenzdetektors erhalten wurden. (c) Absorptionsspektrum des Reaktionsprodukts, erhalten bei einer Retentionszeit von 6,5 Minuten, entsprechend dem Peak von authentischem L-Glühwürmchen-Luciferin. (d) Ausbeuten an L-Glühwürmchen-Luciferin aus der Reaktion von p-Benzochinon mit L-Cystein in verschiedenen Lösungsmitteln (Ergänzungstabelle S2, Einträge 1–12, 29–35). Die auf Cystein basierenden Ausbeuten wurden durch HPLC-Analyse anhand einer Kalibrierungskurve bestimmt (Ergänzende Abbildung S3). ND und Spur bedeuten „nicht nachgewiesen“ bzw. „nicht nachweisbare Ausbeute <0,003 %“. Der pH-Wert der Reaktionsmischung in Wasser betrug aufgrund des Säuregehalts von Cystein 5,0. Die Balken stellen die Mittelwerte ± SD für vier Wiederholungsexperimente dar.

Die oben beschriebene Eintopfbildung von Glühwürmchen-Luciferin erreichte 1 Stunde nach Beginn der Reaktion ein Plateau, wobei weitere Verlängerungen der Reaktionszeit keinen erkennbaren Einfluss auf die Bildung hatten (Ergänzungstabelle S2, Einträge 41–44). Unter verschiedenen neutralen Pufferbedingungen (pH 6,0–7,5) betrugen die durchschnittlichen Erträge 0,13–0,45 %. Die Art des Puffers war für die Bildung von Glühwürmchen-Luciferin nicht wesentlich (Abb. 1d und Ergänzungstabelle S2, Einträge 3–6, 13–18, 31–33). Die Produktion von Glühwürmchen-Luciferin wurde unter den Bedingungen von saurem Puffer (pH 4,0–5,0), basischem Puffer (pH 8,6–9,5), Wasser oder organischen Lösungsmitteln (Methanol, Ethanol oder Acetonitril) nicht oder nur in Spuren nachgewiesen (Abb. 1d, Ergänzungstabelle S2, Einträge 1, 2, 7–12, 29, 30, 34, 35). Die Konzentrationen von p-Benzochinon und L-Cystein im Reaktionsgemisch hatten keinen erkennbaren Einfluss auf die Ausbeute an Glühwürmchen-Luciferin (Ergänzungstabelle S2, Einträge 45–49; Student-t-Test, P > 0,1 für Vergleiche zwischen den Einträgen). Im Gegensatz dazu hatte das Molverhältnis von p-Benzochinon zu L-Cystein einen deutlichen Einfluss auf die Ausbeute (Ergänzungstabelle S2, Einträge 19–28): Die Verwendung eines Überschusses an L-Cystein (p-Benzochinon: L-Cystein = 1:2 oder 1:5) hatte keinen Einfluss auf den Ertrag (Einträge 19, 20, 24, 25; Student-t-Test, P > 0,1 zum Vergleich mit Einträgen 21, 26), wohingegen die Verwendung eines Überschusses an p- Benzochinon (p-Benzochinon:L-Cystein = 2:1 oder 5:1) führte nicht zur Bildung von Glühwürmchen-Luciferin (nicht nachweisbare Werte). Auch die Reaktionstemperatur beeinflusste die Ausbeute: Die Reaktion einer 1:1-Mischung aus p-Benzochinon und L-Cystein bei 4 °C führte zu einer durchschnittlichen Ausbeute an Glühwürmchen-Luciferin von weniger als 0,003 % (Ergänzungstabelle S2, Eintrag 36). Die durchschnittlichen Erträge bei 30 °C, 60 °C und 90 °C betrugen 0,30 %, 0,70 % bzw. 0,22 % (Ergänzungstabelle S2, Einträge 3, 37–38).

Es gab einen erheblichen Rückgang der Ausbeute an Glühwürmchen-Luciferin (weniger als 0,005 %), wenn die Eintopfreaktion unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt wurde (Ergänzungstabelle S2, Eintrag 39). Im Gegensatz dazu verbesserte die Verwendung einer Sauerstoffatmosphäre die Ausbeute nicht (Ergänzungstabelle S2, Eintrag 40; Student-t-Test, P > 0,1 zum Vergleich mit Eintrag 3).

Die HPLC-Analyse mithilfe einer chiralen Säule zeigte, dass durch die Eintopfreaktion von p-Benzochinon mit L-Cystein hergestelltes Glühwürmchen-Luciferin nur die L-Form war, wohingegen die Reaktion von p-Benzochinon mit D-Cystein nur die D-Form aufwies ( Abb. 2a). Die Bildung von natürlichem D-Form-Glühwürmchen-Luciferin aus p-Benzochinon und D-Cystein wurde außerdem durch Zeitverlaufs-Lumineszenzüberwachung in Gegenwart von Glühwürmchen-Luciferase, Mg2+ und ATP nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lumineszenzintensität allmählich zunahm und 40 Minuten nach dem ersten Mischen von p-Benzochinon mit D-Cystein ihren Maximalwert erreichte (Abb. 2b).

Enantioselektive Bildung von Glühwürmchen-Luciferin aus p-Benzochinon und D-Cystein oder L-Cystein.

(a) Chirale HPLC-Analyse der Reaktionsprodukte aus p-Benzochinon und D-Cystein oder L-Cystein. (b) Lumineszenz einer Mischung aus p-Benzochinon und D-Cystein oder L-Cystein in Gegenwart von ATP, Mg2+ und Glühwürmchen-Luciferase.

Die LC/ESI-TOF-MS-Analyse von Glühwürmchen-Luciferin, das aus p-Benzochinon und L-[U-13C3]-Cystein gebildet wurde, zeigte, dass ein Kohlenstoffatom des Cysteins während der Eintopfbildung von Glühwürmchen-Luciferin eliminiert wurde (Ergänzende Abbildung S2). ). Die HMBC-Analyse des Glühwürmchen-Luciferins, das durch die Eintopfreaktion von p-Benzochinon mit L-[1-13C]-Cystein gebildet wurde, zeigte, dass H-4 (δ 5,19) und H-5 (δ 3,71 und 3,75) mit dem korrelierten Carbonylkohlenstoff (δ 177,8), was darauf hinweist, dass das Carbonylkohlenstoffatom das einzige Atom war, das mit 13C angereichert war (ergänzende Abbildung S4). Diese Daten legen daher nahe, dass das C-1-Kohlenstoffatom eines Cysteins während der Benzothiazol-Ringbildung von Firefly-Luciferin eliminiert wurde (Abb. 3a).

Schemata zur Bildung von Glühwürmchen-Luciferin unter neutralen Pufferbedingungen.

(a) Herkunft der Kohlenstoffe im Glühwürmchen-Luciferin, das durch die Eintopfreaktion erzeugt wird. (b) Produkte, die durch die Reaktion von p-Benzochinon mit Cystein (1:1) in Ammoniumacetatpuffer (pH 7,0) erhalten wurden. Die Ausbeuten der Verbindungen 1 und 2 sowie die von Firefly-Luciferin (siehe Abb. 1d) basierten auf p-Benzochinon bzw. Cystein. Die Verbindungen 1 und 2 wurden durch die Reaktion mit Cystein in Ammoniumacetatpuffer (pH 7,0) in Spuren bzw. 0,05 % Ausbeute in Glühwürmchen-Luciferin umgewandelt.

Die HMBC-Analyse des Glühwürmchen-Luciferins, das durch die Eintopfreaktion von p-Benzochinon mit L-[3-13C]-Cystein gebildet wurde, zeigte Korrelationen von H-4 (δ 5,19) zu C-2 (δ 165,2) und C-5 ( δ 37,3), was darauf hinweist, dass die Kohlenstoffatome C-2 und C-5 die einzigen Kohlenstoffe waren, die mit 13C angereichert waren (ergänzende Abbildung S5). Diese Daten legen daher nahe, dass die C-2′- und C-2-Kohlenstoffatome des Glühwürmchen-Luciferins von den C-2- bzw. C-3-Kohlenstoffatomen des Cysteins abgeleitet sind (Abb. 3a).

HPLC-, NMR- und MS-Analysen ergaben, dass S-(2,5-Dihydroxyphenyl)cystein (1) und 6-Hydroxybenzothiazol-2-carbaldehyd (2) sowie Glühwürmchen-Luciferin während der Eintopfreaktion von p- gebildet wurden. Benzochinon mit L-Cystein (Ergänzende Abbildungen S6 und S7). In diesem Experiment betrugen die Ausbeuten der Verbindungen 1, 2 25,8 % (bestimmt durch HPLC) bzw. 0,015 % (bestimmt durch NMR) (Abb. 3b). Unter den gleichen Reaktionsbedingungen konnten wir durch HPLC-Analyse die Produktion von Hydrochinon in einer Ausbeute von 24,1 % nachweisen (ergänzende Abbildung S8). Unter einer 90 mM Ammoniumacetat-Bedingung (pH 7,0) für 3 Stunden bei 30 °C ergab die Reaktion von Verbindung 2 mit D-Cystein Glühwürmchen-Luciferin in 0,047 % Ausbeute und 2-(6′-Hydroxy-2′-benzothiazolyl)- 2-Thiazolidin-4-carbonsäure (3) in 44,0 % Ausbeute (isolierte Ausbeute) (Abb. 3b und ergänzende Abb. S9), während die Reaktion von Verbindung 1 mit D-Cystein nur Spuren von Glühwürmchen-Luciferin ergab (ergänzende Abb . S10) und 94,0 % Rückgewinnung von Verbindung 1.

In dieser Studie haben wir eine neuartige Eintopfreaktion zur Herstellung von Glühwürmchen-Luciferin aus p-Benzochinon und Cystein in einem neutralen Puffer ohne synthetische Reagenzien oder Enzyme unter einer Luftatmosphäre bei Umgebungstemperatur demonstriert. Obwohl die Produktion unter verschiedenen neutralen Pufferbedingungen erfolgte, wurde sie unter sauren oder basischen Pufferbedingungen, in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, unter einer Stickstoffatmosphäre oder bei niedrigeren Temperaturen gehemmt oder vollständig verhindert. Die Ausbeuten an Glühwürmchen-Luciferin waren in jedem Experiment sehr niedrig und schwankend, aber die durch einen numerischen Wert dargestellten Ausbeuten waren mindestens zehnmal höher als die durch „ND“ oder „Spur“ dargestellten Ausbeuten (siehe Ergänzungstabelle S2). Daher erforderte die Eintopfbildung von Glühwürmchen-Luciferin neutrale pH-Bedingungen und Sauerstoff. Die pH-Abhängigkeit der Bildung von Glühwürmchen-Luciferin kann auf das Vorhandensein freier Amino- und Carboxylgruppen in Cystein zurückgeführt werden. In einer chemischen Synthesestudie mit ungeschützten Aminosäuren in wässriger Lösung haben Yokoyama et al. zeigten, dass das Reaktionsprodukt von den Ionisierungszuständen der Amino- und Carboxylgruppen der Aminosäuren während der chemischen Reaktion abhängt23. Wir haben keine konkreten Vorstellungen über die Rolle von Sauerstoff bei der Bildung von Glühwürmchen-Luciferin in der Eintopfreaktion. McCapra und Razavi berichteten jedoch, dass für die Bildung von 6-Hydroxybenzothiazol-2-carboxamid aus 7-Acetyloxybenzothiazin-3-carboxamid in Gegenwart von Natriumethoxid in trockenem Ethanol Sauerstoff erforderlich war. Auf der Grundlage dieses Ergebnisses schlugen sie vor, dass die Ringkontraktion von Benzothiazin zu Benzothiazol über ein intermediäres Peroxid erfolgt13. Als unsere Eintopfreaktion 3 Stunden lang bei 4 °C durchgeführt wurde, wurde Glühwürmchen-Luciferin in nicht nachweisbaren Mengen produziert, aber als die resultierende Lösung 3 Stunden lang weiter bei 30 °C gerührt wurde, wurde eine Ausbeute von 0,09 % nachgewiesen (Daten nicht). gezeigt). Dieses Ergebnis zeigt, dass die niedrige Reaktionsgeschwindigkeit die Bildung bei 4 °C inhibierte.

Übermäßige p-Benzochinon-Bedingungen (p-Benzochinon:Cystein = 2:1 oder 5:1 mol/mol) führten zu einem dramatischen Rückgang der Ausbeute an Glühwürmchen-Luciferin, was darauf hindeutet, dass das Molverhältnis von p-Benzochinon zu Cystein ein kritischer Prozess war Parameter für die Bildung von Glühwürmchen-Luciferin. Die Reaktion einer 2:1 (Mol/Mol)-Mischung von p-Benzochinon mit Cystein wurde zuvor sowohl in Wasser als auch in Phosphatpuffer (pH 6)24,25 untersucht. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass die Reaktionen Verbindung 1, Chinonimine, Benzothiazine und mehrere zugehörige Polymere ergaben, jedoch kein Glühwürmchen-Luciferin. Es wurde angenommen, dass die Verwendung eines Überschusses an p-Benzochinon gegenüber Cystein Nebenreaktionen wie die Polymerisation fördern und dadurch die Bildung von Glühwürmchen-Luciferin verhindern würde. Tatsächlich beobachteten wir unter den Bedingungen eines Überschusses an p-Benzochinon, dass die Reaktionsmischung eine dunklere Farbe annahm und eine größere Menge an Niederschlägen lieferte, verglichen mit der Verwendung einer 1:1-Bedingung (Mol/Mol).

Die NMR-Analyse des Glühwürmchen-Luciferins, das durch die Eintopfreaktion von p-Benzochinon mit L-[1-13C]-Cystein gebildet wurde, zeigte, dass während der Benzothiazol-Ringbildung eine Decarboxylierung von Cystein stattfand. Dies steht im Einklang mit unserer früheren Feststellung, dass D-Glühwürmchen-Luciferin in vivo über die Decarboxylierung von L-Cystein biosynthetisiert wurde14.

Die NMR-Analyse des Glühwürmchen-Luciferins, das durch die Eintopfreaktion von p-Benzochinon mit L-[3-13C]-Cystein gebildet wurde, ergab, dass die C-2′- und C-2-Kohlenstoffatome des Glühwürmchen-Luciferins vom C- 2 bzw. C-3 Kohlenstoffatome von Cystein. Dieses Ergebnis legt nahe, dass der Benzothiazolring des Glühwürmchen-Luciferins durch eine Kohlenstoff-Schwefel-Bindungsumlagerung von Cystein in der Eintopfreaktion gebildet wurde. Es ist bemerkenswert, dass ähnliche Umlagerungsprozesse für die Bildung des Benzothiazolrings in Studien zur Biosynthese des Antibiotikums Rifamycine26,27,28 und zur biomimetischen Oxidation des Phäomelanin-Vorläufers 5-S-Cysteinyldopa29 gezeigt wurden.

Wir fanden heraus, dass die Eintopfreaktion auch die Verbindungen 1 und 2 ergab. Die Bildung von Verbindung 1 steht im Einklang mit einem früheren Bericht, dass Verbindung 1 durch die Reaktion von p-Benzochinon mit Cystein in Phosphatpuffer (pH 6) gebildet wurde25. In diesem Artikel wurde auch beschrieben, dass Verbindung 1 in Gegenwart von p-Benzochinon25 weiter in Benzothiazin umgewandelt wurde. Wir haben das Benzothiazin-Produkt nicht identifiziert, aber m/z-Ionen von 166,0 und 182,0 nachgewiesen, was den Protonenaddukten von 7-Hydroxybenzothiazin bzw. 2,7-Dihydroxybenzothiazin im m/z-Wert in der Eintopf-Reaktionsmischung nach Masse entspricht Spektrometrie (Ergänzende Abbildung S11). Im Hinblick auf die Bildung von Verbindung 2 wurde vermutet, dass die Benzothiazol-2-carbaldehyd-Struktur biosynthetisch aus der Benzothiazin-Struktur gebildet wurde10,11,30. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse erwarteten wir, dass Verbindung 1 durch Oxidation durch p-Benzochinon in Benzothiazin-Zwischenprodukte umgewandelt wurde und anschließend die Ringkontraktion erfolgte, um Verbindung 2 zu ergeben. Tatsächlich konnten wir nach der Eintopfreaktion Hydrochinon in einer Ausbeute von 24,1 % nachweisen . Es wurde berichtet, dass die Kondensation von Acetaldehyd mit Cystein in Wasser 2-Methylthiazolidin-4-carbonsäure ergibt, während die ursprüngliche Konfiguration des Cystein-Stereozentrums31 erhalten bleibt, und dass 2-Thiazoline aus 2-Thiazolidinen durch Ru/PPh3 oder Ru/ synthetisiert werden können. TMEDA-katalysierte Oxidation mit TBHP bei Umgebungstemperatur32. Diese Ergebnisse stimmen mit der Tatsache überein, dass die ursprüngliche Konfiguration des Cystein-Stereozentrums durch die Bildung der Thiazolin-Einheit in der Eintopfreaktion beibehalten wurde (Abb. 2). Unter Berücksichtigung der vorherigen und vorliegenden Ergebnisse haben wir vorläufig einen Reaktionsweg für Glühwürmchen-Luciferin aus p-Benzochinon und Cystein über die Verbindungen 1 und 2 vorgeschlagen (ergänzende Abbildung S12).

Anschließend haben wir die Verbindungen 1 und 2 chemisch synthetisiert und ihre Reaktion mit Cystein unter neutralen Pufferbedingungen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Reaktion von Verbindung 2 mit Cystein Glühwürmchen-Luciferin in geringer Ausbeute (0,05 %) und Verbindung 3 als Hauptprodukt ergab, wohingegen die Reaktion von Verbindung 1 ein Spurensignal ergab, das authentischem Glühwürmchen-Luciferin entsprach, mit nahezu quantitativer Rückgewinnung der Verbindung 1 in der HPLC-Analyse. Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass die Verbindungen 1 und 2 mögliche Zwischenprodukte für die Bildung von Glühwürmchen-Luciferin während der Eintopfreaktion sind. Allerdings werden detaillierte Untersuchungen notwendig sein, um den Mechanismus zu klären, der der Ein-Topf-Bildung von Glühwürmchen-Luciferin zugrunde liegt.

Wir gehen derzeit davon aus, dass die Verbindungen 1 und 2 auch die biosynthetischen Zwischenprodukte in vivo sind, da 1) die Benzothiazol-2-carbaldehyd-Struktur und S-(2,5-Dihydroxyphenyl)cystein in der Natur vorkommen11,33, 2) die Eintopfbildung von Glühwürmchen-Luciferin erfolgte unter milden Bedingungen und 3) die Decarboxylierung von Cystein während der Eintopfreaktion stimmte mit unseren Erkenntnissen in unserem vorherigen In-vivo-Experiment überein14. Andererseits wurde vorgeschlagen, dass 6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonsäure und 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol biosynthetische Zwischenprodukte von Glühwürmchen-Luciferin sind34. In Experimenten mit Glühwürmchenschwanzextrakten haben Day et al. fanden keine Hinweise darauf, dass 6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonsäure als Käfer-Luciferin-Vorläufer fungieren könnte34. Es ist bekannt, dass 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol unter neutralen wässrigen Bedingungen leicht mit Cystein reagiert, um Glühwürmchen-Luciferin zu ergeben35,36 und Gomi et al. schlugen vor, dass 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol aus Glühwürmchen-Oxyluciferin durch ein Luciferin-regenerierendes Enzym erzeugt und für die nichtenzymatische Regeneration von Glühwürmchen-Luciferin in vivo verwendet wurde37. Allerdings ist die Bildung von 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol durch die Eintopfreaktion in der organischen Chemie unwahrscheinlich. Daher wird 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol nicht als Zwischenprodukt für die Bildung von Glühwürmchen-Luciferin in der Eintopfreaktion angesehen.

Es ist bemerkenswert, dass es zwei grundlegende Unterschiede zwischen dieser Eintopfreaktion und dem In-vivo-Biosyntheseprozess von Glühwürmchen-Luciferin gibt14. Erstens ergab die Eintopfreaktion von Hydrochinon (anstelle von p-Benzochinon) kein Glühwürmchen-Luciferin (Ergänzungstabelle S2, Einträge 50 und 51), was nicht mit der Tatsache übereinstimmt, dass Glühwürmchen-Luciferin aus Hydrochinon biosynthetisiert wird14. Zweitens ergab die Eintopfreaktion von p-Benzochinon mit L-Cystein nur Glühwürmchen-Luciferin in L-Form (Abb. 2), wohingegen Glühwürmchen-Luciferin in D-Form aus L-Cystein biosynthetisiert wird14. Hydrochinon kann in Organismen in p-Benzochinon umgewandelt werden38,39. Darüber hinaus wurde vermutet, dass D-Glühwürmchen-Luciferin aus L-Glühwürmchen-Luciferin durch Coenzym-A-Veresterung durch Luciferase und die anschließende Racemisierung und Hydrolyse in erwachsenen Glühwürmchen erzeugt wird40. Daher deuten die beiden grundlegenden Unterschiede darauf hin, dass unsere Eintopfreaktion die mittleren Kernschritte der D-Glühwürmchen-Luciferin-Biosynthese darstellt: zwischen „von Hydrochinon zu p-Benzochinon“ und „von L-Glühwürmchen-Luciferin zu D-Glühwürmchen-Luciferin“. Unsere vorliegenden Ergebnisse legen nahe, dass sich im Leben Glühwürmchen-Luciferin bilden kann, da p-Benzochinon und Cystein die primären organischen Verbindungen sind, die von verschiedenen Organismen, einschließlich Insekten, produziert werden38,39,41,42,43,44. Wir gingen davon aus, dass die Effizienz der Luciferin-Produktion von Glühwürmchen aus p-Benzochinon und Cystein in den frühen Evolutionsstadien sehr gering sein würde, sich aber durch den Erwerb der biosynthetischen Enzyme verbessern würde, die mittlere Kernschritte der Luciferin-Bildung in der Abstammungslinie von katalysieren leuchtende Käfer.

Bisher wurden verschiedene Methoden zur chemischen Synthese von Glühwürmchen-Luciferin entwickelt, um dieses wertvolle biologische Werkzeug leicht zugänglich zu machen5,45,46,47,48,49,50. Diese Methoden erfordern Wärme, Inertgas, organische Lösungsmittel und verschiedene synthetische Reagenzien, darunter starke Reduktions- und Oxidationsmittel, Basen, Säuren und Metallkatalysatoren. Bemerkenswerterweise umfasste der letzte Schritt in all diesen mehrstufigen Synthesen die Kondensation von 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol mit Cystein. Im Gegensatz dazu fand die in der aktuellen Studie gezeigte Reaktion unter milden Bedingungen im Eintopfverfahren statt und verlief nicht über 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol. Eine detaillierte Analyse unseres Eintopf-Reaktionsmechanismus könnte daher neue Horizonte für die Entwicklung alternativer Strategien für die chemische Synthese von Glühwürmchen-Luciferin und seinen Analoga eröffnen, obwohl unsere Reaktionsbedingungen aufgrund der sehr geringen Ausbeute nicht direkt auf die Laborproduktion angewendet werden können .

Zusammenfassend haben wir zum ersten Mal die Produktion von Glühwürmchen-Luciferin aus p-Benzochinon und Cystein durch einen wässrigen Eintopfansatz demonstriert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass der Benzothiazolring des Glühwürmchen-Luciferins durch Decarboxylierung und Kohlenstoff-Schwefel-Bindungsumlagerung von Cystein in der Eintopfreaktion gebildet wurde. Der evolutionäre Ursprung der Glühwürmchen-Luciferase wurde anhand molekularer und biochemischer Analysen unter Verwendung von Luciferasen und ihren Homologen in Käfern untersucht51, die Studien zum Ursprung von Glühwürmchen-Luciferin wurden jedoch nur wenig untersucht34. Unsere vorliegende Studie zeigt, dass Glühwürmchen-Luciferin das Potenzial hat, leicht im Leben entstehen zu können.

Die in der vorliegenden Studie verwendeten Materialien wurden von den folgenden kommerziellen Lieferanten bezogen: L-Cystein, p-Benzochinon (Kanto Chemical, Tokio, Japan); D-Cystein, L-Cysteinethylesterhydrochlorid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); D-Firefly-Luciferin (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan); Hydrochinon (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan); ATP (Orientalische Hefe, Osaka, Japan); und rekombinante Photinus pyralis-Luciferase QuantiLum (Promega, Madison, WI, USA). L-[U-13C3]-Cystein (98 % Isotopenreinheit), L-[1-13C]-Cystein (99 % Isotopenreinheit), L-[3-13C]-Cystein (99 % Isotopenreinheit) wurden gekauft von Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA). Die chemische Reinheit dieser Isotopenverbindungen lag bei über 98 %. L-Firefly-Luciferin wurde freundlicherweise von Dr. Yoshiaki Toya (Aichi Univ. of Education, Aichi, Japan) zur Verfügung gestellt. Alle Materialien wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Es ist bemerkenswert, dass die L-Cystein- und p-Benzochinon-Lösungen beide unmittelbar vor ihrer Verwendung in den folgenden Experimenten hergestellt wurden.

Die chirale HPLC-Analyse wurde auf einem PU-1580 HPLC-System (Jasco, Tokio, Japan) durchgeführt, das mit einer chiralen Säule, CHIRALCEL OD-RH (ϕ 4,6 × 150 mm; Daicel Chemical Industry, Tokio, Japan), einem Multiwellenlängendetektor (MD) ausgestattet war -2018 Plus, Jasco) und einem Fluoreszenzdetektor (FP-1520, Jasco). Die für die Elution des HPLC-Systems verwendeten Bedingungen waren wie folgt: mobile Phase, 27 % (v/v) Acetonitril in H2O mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure; Flussrate 1,0 ml/min; Fluoreszenzdetektion, Anregung/Emission, 330/530 nm.

Die für die Analysen verwendeten Puffer und Lösungsmittel waren wie folgt: 100 mM Natriumcitratpuffer (pH 3,9), Natriumacetatpuffer (pH 4,0), Universalpuffer (Britton-Robinson-Puffer52) (pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 7,5, 8,6, 9,5), Ammoniumacetat (pH 7,0), KH2PO4-KOH (pH 7,5), HEPES-KOH (pH 7,5), Tris-HCl (pH 7,5), Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,5), Glycin-NaOH (pH 9.5), Wasser, Ethanol, Methanol und Acetonitril. Zu 90 μL Puffer/Lösungsmittel in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen wurden 5 μL einer 80 mM wässrigen Lösung von L-Cystein und 5 μL einer 80 mM wässrigen Lösung von p-Benzochinon gegeben. Die Mischung wurde mit einem Mikromischer (Modell E-36; Taitec, Saitama, Japan) im Hochgeschwindigkeitsmodus 3 Stunden lang bei 30 °C gerührt. Für jede Reaktion haben wir mithilfe von pH-Testpapier (Toyo Roshi, Tokio, Japan) bestätigt, dass der pH-Wert der Reaktionsmischung nach der Reaktion unverändert blieb. Die resultierende Lösung wurde mit 400 μL H2O verdünnt und mit 10 μL 3 M HCl auf einen pH-Wert unter 3 angesäuert. Die angesäuerte Lösung wurde mit Ethylacetat (500 μL × 2) extrahiert. Die kombinierte organische Schicht wurde unter einem Stickstoffstrom bei Raumtemperatur zur Trockne konzentriert und unter Verwendung eines Ultraschallgeräts (Modell UT-206; Sharp, Osaka, Japan) in 100 μl Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wurde 3 Minuten lang bei 4 ° C und 17.400 × g zentrifugiert und 10 μl des Überstands wurden einer chiralen HPLC-Analyse unterzogen. Die Absorptionsspektren von Glühwürmchen-Luciferin wurden mit einem Multiwellenlängendetektor erhalten.

Unmittelbar vor diesem Experiment wurde eine Lösung von D-Cystein (oder L-Cystein) in Tris-HCl (pH 7,5) mit wässrigen Lösungen von ATP und MgCl2 gemischt. Zu der Mischung wurden wässrige p-Benzochinonlösung und Glühwürmchen-Luciferase in Tris-HCl (pH 7,5) gegeben, gefolgt von einer sofortigen Lumineszenzüberwachung mit einem Centro LB960-Luminometer (Berthold, Bad Wildbad, Deutschland) für 21.600 s in 60-s-Intervallen. Die endgültige Mischung (110 μl) enthielt 4 mM p-Benzochinon, 4 mM D-Cystein (oder L-Cystein), 2 mM ATP, 10 mM MgCl2 und 1,27 μg rekombinante Photinus pyralis-Luciferase in 82 mM Tris-HCl (pH 7,5). ).

Zu 500 μl einer 80 mM Lösung von L-[1-13C]-Cystein in 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) in einem 1,5 ml Mikroröhrchen wurde eine einzelne Portion von 500 μl einer 80 mM wässrigen Lösung von p- Benzochinon. Nach 3-stündigem Rühren mit einem Mikromischer (Modell E-36; Taitec) im Hochgeschwindigkeitsmodus bei 30 °C wurde die resultierende Lösung mit Ethylacetat (1 ml × 1) gewaschen und die wässrige Schicht mit 12 μl angesäuert von 3 M HCl auf einen pH-Wert unter 3 eingestellt. Die angesäuerte Lösung wurde mit Ethylacetat (1 ml × 1) extrahiert. Die organische Schicht wurde unter einem Stickstoffstrom bei Raumtemperatur zur Trockne eingeengt und in 100 μl Methanol gelöst. Die gesamte Lösung wurde durch einen Ultrafree-MC-Zentrifugalfilter (0,45 μm; Millipore, Billerica, MA, USA) filtriert. Das gesamte Filtrat wurde einer HPLC-Trennung mit einer Develosil ODS-UG-5-Säule (ϕ 4,6 × 250 mM; Nomura Chemical, Aichi, Japan), einem Multiwellenlängendetektor (MD-2010 Plus, Jasco) und einem Fluoreszenzdetektor (FP) unterzogen -1520, Jasco). Die HPLC-Bedingungen waren wie folgt: mobile Phase, linearer Gradient von Methanol in H2O mit 0,1 % Ameisensäure von 10 bis 100 % für 45 Minuten; Flussrate 0,6 ml/min; UV-Detektion, 327 nm; Fluoreszenzdetektion, Anregung/Emission, 330/530 nm. Die bei einer Retentionszeit von 35,5 bis 37,0 Minuten eluierte Fraktion wurde unter einem Stickstoffstrom bei Raumtemperatur zur Trockne eingeengt und im Vakuum weiter getrocknet. Der Rückstand (der ungefähr 4 μg Glühwürmchen-Luciferin enthielt, geschätzt durch UV-Absorption) wurde in CD3OD gelöst und die Lösung mit einem AVANCE III HD 600 Cryo-Probe NMR-Spektrometer (Bruker, Billerica, MA, USA) analysiert.

Zu 500 μl einer 80 mM Lösung von L-[3-13C]-Cystein in 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) in einem 1,5 ml Mikroröhrchen wurde eine einzelne Portion von 500 μl einer 80 mM wässrigen Lösung von p- Benzochinon. Nach 3-stündigem Rühren mit einem Mikromischer (Modell E-36; Taitec) im Hochgeschwindigkeitsmodus bei 30 °C wurde die resultierende Lösung mithilfe eines HPLC-Systems gemäß der im vorherigen Abschnitt beschriebenen Methode getrennt. Die bei einer Retentionszeit von 34,4 bis 36,4 Minuten eluierte Fraktion wurde unter einem Stickstoffstrom bei Raumtemperatur zur Trockne eingeengt und im Vakuum weiter getrocknet. Der Rückstand (der ungefähr 12 μg Glühwürmchen-Luciferin enthielt, geschätzt durch UV-Absorption) wurde in CD3OD gelöst und die Lösung wurde mit einem AVANCE III HD 600 Cryo-Probe NMR-Spektrometer (Bruker) analysiert.

Zu 50 ml einer 40 mM Lösung von L-Cystein in 180 mM Ammoniumacetat (pH 7,0) in einem 500 ml Erlenmeyerkolben wurde eine einzelne Portion von 50 ml einer 40 mM wässrigen Lösung von p-Benzochinon gegeben. Die gleiche Reaktion wurde auch in einem separaten Kolben durchgeführt. Nach 3-stündigem Rühren (180 U/min) mit einem Bioshaker (Modell BP-98; TIC, Saitama, Japan) bei 30 °C wurden die aus beiden Reaktionen erhaltenen Lösungen kombiniert und mit Diethylether (150 ml × 2) gewaschen. und mit Ethylacetat (200 ml × 2) getrennt. Um Verbindung 1 zu identifizieren, wurden 10 μl der wässrigen Schicht einer chiralen HPLC-Analyse unterzogen. Die bei einer Retentionszeit von 11 bis 12 Minuten eluierte Fraktion wurde einer HRMS-Analyse unterzogen. Um Glühwürmchen-Luciferin zu identifizieren, wurden 100 μl der wässrigen Schicht mit 400 μl H2O verdünnt und mit 10 μl 3 M HCl auf einen pH-Wert unter 3 angesäuert. Die angesäuerte Lösung wurde mit Ethylacetat (500 μl × 2) extrahiert. Die organische Schicht wurde unter einem Stickstoffstrom bei Raumtemperatur zur Trockne eingeengt und mit einem Ultraschallgerät (Modell UT-206; Sharp) in 100 μl H2O gelöst. Die wässrige Lösung wurde 3 Minuten lang bei 4 ° C und 17.400 × g zentrifugiert und 10 μl des Überstands wurden einer chiralen HPLC-Analyse unterzogen. Um Verbindung 2 zu identifizieren, wurden 400 ml der zuerst erhaltenen Ethylacetatschicht mit Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet. Die Lösung wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt und im Vakuum weiter getrocknet. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (Kieselgel 5 g; Hexan-Ethylacetat, 2:1 – v/v) gereinigt. Der gereinigte Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (Kieselgel 5 g; Dichlormethan-Methanol, 98:2 – v/v) weiter gereinigt. Das gereinigte Produkt (2,2 mg) wurde 1H-NMR- und HRMS-Analysen unterzogen.

Zitierweise für diesen Artikel: Kanie, S. et al. Nicht-enzymatische Eintopfbildung von Glühwürmchen-Luciferin in einem neutralen Puffer aus p-Benzochinon und Cystein. Wissenschaft. Rep. 6, 24794; doi: 10.1038/srep24794 (2016).

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Referenzen herunterladen

Wir danken Herrn K. Koga (Grad. School of Bioagricultural Sci., Nagoya Univ., Japan) für die NMR-Analyse mit einem NMR-Spektrometer, das mit einer kryogen gekühlten Sonde ausgestattet ist, sowie Herrn S. Kitamura, Frau R. Takama und Frau Y. Kawai (Grad. School of Bioagricultural Sci., Nagoya Univ., Japan) für die MS-Analyse. Diese Arbeit wurde vom Program for Leading Graduate Schools „Integrative Graduate Education and Research in Green Natural Sciences“, MEXT, Japan, unterstützt. Dieses Manuskript wurde von einem professionellen Lektorat für die englische Sprache bearbeitet.

Graduiertenschule für Bioagrarwissenschaften, Universität Nagoya, 464-8601, Nagoya, Japan

Shusei Kanie, Toshio Nishikawa, Makoto Ojika und Yuichi Oba

Abteilung für Umweltbiologie, Hochschule für Biowissenschaften und Biotechnologie, Chubu-Universität, Kasugai, 487-8501, Japan

Yuichi Oba

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SK und YO haben die Experimente konzipiert und gestaltet. SK führte die Experimente durch. SK, TN, MO und YO analysierten die Daten. YO, TN und MO steuerten Reagenzien/Materialien/Analysewerkzeuge bei. SK und YO haben den Hauptmanuskripttext geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Kanie, S., Nishikawa, T., Ojika, M. et al. Nicht-enzymatische Eintopfbildung von Glühwürmchen-Luciferin in einem neutralen Puffer aus p-Benzochinon und Cystein. Sci Rep 6, 24794 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24794

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Eingegangen: 18. Dezember 2015

Angenommen: 5. April 2016

Veröffentlicht: 21. April 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24794

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