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Jul 07, 2023

Folgen einer Nosema apis-Infektion für männliche Honigbienen und ihre Fruchtbarkeit

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 10565 (2015) Diesen Artikel zitieren 5743 Zugriffe 30 Zitate 21 Details zu altmetrischen Metriken Die Königinnen eusozialer Bienen, Ameisen und Wespen paaren sich nur während einer sehr langen Zeit

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 10565 (2015) Diesen Artikel zitieren

5743 Zugriffe

30 Zitate

21 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Königinnen eusozialer Bienen, Ameisen und Wespen paaren sich nur während einer sehr kurzen Zeitspanne im frühen Leben und die Männchen produzieren daher Ejakulate, die aus einer großen Anzahl hochwertiger Spermien bestehen. Eine solche extreme Selektion auf hohe Fruchtbarkeit führte dazu, dass die Männchen nur minimal in ihr somatisches Überleben, einschließlich ihres Immunsystems, investierten. Wenn anfällige Männchen jedoch nicht in der Lage sind, ihr Fortpflanzungsgewebe vor Infektionen zu schützen, beeinträchtigen sie die Fitness der Königin, wenn sie während der Paarung Krankheitserreger übertragen. Wir haben die Honigbiene Apis mellifera genutzt und den Infektionsverlauf des sexuell übertragbaren Erregers Nosema apis untersucht. Wir haben vorhergesagt, dass Honigbienenmännchen anfällig sind, ihr Fortpflanzungsgewebe jedoch vor Infektionen schützen. Wir untersuchten die Auswirkungen von N. apis-Infektionen auf den Mitteldarm, die akzessorischen Drüsen und die akzessorischen Hoden und quantifizierten die Folgen einer Infektion auf das Überleben und die Fruchtbarkeit des Mannes. Wir fanden heraus, dass N. apis in der Lage ist, Männchen zu infizieren, und dass sich die Infektion mit fortschreitender Infektion deutlich auf die Fruchtbarkeit und das Überleben älterer Männchen auswirkte. Obwohl wir bestätigen, dass Männer in der Lage sind, N. apis-Infektionen ihres Fortpflanzungsgewebes zu minimieren, ist der Parasit in Ejakulaten älterer Männer vorhanden. Infolgedessen hat N. apis alternative Wege entwickelt, um Ejakulation erfolgreich zu infizieren und sexuell übertragen zu werden.

Die Paarungsbiologie eusozialer Ameisen, Bienen und Wespen ist wirklich spektakulär, da fortpflanzungsfähige Weibchen (Königinnen) nur während einer sehr kurzen Zeitspanne zu Beginn ihres Lebens kopulieren, wenn sie einen lebenslangen Vorrat an Spermien erwerben und speichern1,2,3. Da Königinnen im späteren Leben nie mehr Sperma nachfüllen, ist die Spermiennutzung und -sparsamkeit bei den Arten, die Kolonien mit Millionen von Arbeiterinnen unterhalten3,4,5,6 und/oder jahrzehntelang auf dem Feld überleben4,7,8, auf unnachahmliche Extreme getrieben. Um Königinnen mit einer ausreichenden Anzahl an Spermien zu versorgen, entwickelten soziale Insektenmännchen Ejakulate, die eine große Anzahl an Spermien von außergewöhnlich hoher Qualität enthalten3,9. Die Produktion und Aufrechterhaltung solcher Ejakulate vor der Paarung verursacht erhebliche Kosten für eusoziale Insektenmännchen5,10. Es wird daher angenommen, dass sie an ihren physiologischen Grenzen arbeiten, wo bereits die geringste Störung oder Veränderung in ihrer Umgebung ihre Fruchtbarkeit beeinträchtigen kann11. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass diese Männchen nur minimal in ihr somatisches Überleben investieren, um ihr Fortpflanzungspotenzial zu maximieren5,10.

Die Immunität sozialer Insektenmännchen wird auch durch ihre Genetik beeinflusst, da sie aus unbefruchteten Eiern stammen und haploide Tiere sind, was vermutlich ihre Anfälligkeit für Parasiten zusätzlich erhöht12. Daher ist es besonders interessant, Immunprobleme zu untersuchen, die aus parasitären Infektionen bei männlichen eusozialen Insekten resultieren. Empirische Arbeiten haben bestätigt, dass die Immunantworten männlicher sozialer Insekten durchweg geringer sind als die weiblicher Arbeiter, z. B. bei Blattschneiderameisen13, Waldameisen14 oder Hummeln15. Es wird angenommen, dass die daraus resultierende Anfälligkeit sozialer Insektenmännchen für Parasitismus zu einer Reihe lebensgeschichtlicher Anpassungen geführt hat, die das Infektionsrisiko eines Männchens verringern: Beispielsweise haben sie eine kurze Lebenserwartung, sind vollständig von Arbeitskräften abhängig und leisten keine Hilfe ihre Kolonie. Es ist jedoch bekannt, dass soziale Insekten eine Reihe von Parasiten beherbergen, die sich leicht in ihren Kolonien ausbreiten, die aus einer großen Anzahl verwandter Individuen, darunter auch Männchen, bestehen16,17. Die Anfälligkeit der Männchen könnte daher die Möglichkeiten einer Kolonie, Infektionen zu kontrollieren, verringern und die Fitness der Kolonie weiter beeinträchtigen, insbesondere wenn solche Infektionen die Fruchtbarkeit, Lebenserwartung oder Wettbewerbsfähigkeit der Männchen verringern. Schließlich könnte die männliche Anfälligkeit auch dazu führen, dass sich Krankheitserreger in ihrem Körper ausbreiten und schließlich ihre Fortpflanzungsorgane infizieren. In einem solchen Fall könnten sexuell übertragbare Krankheitserreger dann generationsübergreifende Kosten verursachen. Allerdings wurden sexuell übertragbare Krankheiten und ihre Folgen bei sozialen Insekten nicht im Detail untersucht18,19,20. Hier stellen wir die Hypothese auf, dass soziale Insektenmännchen das Risiko einer Krankheitsübertragung auf Königinnen minimieren sollten, indem sie ihr Fortpflanzungsgewebe vor Parasiteninfektionen schützen.

Um diese Idee zu testen, haben wir die Honigbiene A. mellifera ligustica genutzt und die Auswirkungen einer Infektion mit der weit verbreiteten Pilzkrankheit Nosema apis untersucht. Honigbienen sind aus mehreren Gründen interessante Studienorganismen, um die Auswirkungen von Infektionen auf die männliche Immunität und Fruchtbarkeit aufzuklären. Erstens ist bekannt, dass sie eine Vielzahl von Parasiten beherbergen21,22 und zweitens sind viele davon unter den Koloniemitgliedern weit verbreitet und häufig genug vorhanden, um eine potenzielle Bedrohung für Männchen (Drohnen) darzustellen. Darüber hinaus wurde das Virus der deformierten Flügel erfolgreich im Ejakulat von Honigbienen identifiziert, was darauf hindeutet, dass einige Honigbienenkrankheiten sexuell übertragen werden könnten19,23. In jüngerer Zeit wurde über das Vorkommen von N. apis in Ejakulaten von Honigbienendrohnen berichtet, und Experimente mit künstlicher Befruchtung bestätigten, dass dieser Erreger grundsätzlich während der Paarung übertragen werden kann24. Folglich ist N. apis ein idealer Studienorganismus, um die Auswirkungen von Parasiten auf die männliche Fruchtbarkeit zu testen und um zu testen, ob die männliche Anfälligkeit eine Ausbreitung einer Krankheit sowohl auf die Fortpflanzungsorgane als auch auf das Ejakulat ermöglicht. Um dies zu testen, führten wir eine Reihe von Experimenten durch, um die Auswirkungen einer N. apis-Infektion auf das Körpergewebe eines Mannes aufzudecken, indem wir infiziertes Körpergewebe von Drohnen unterschiedlichen Alters untersuchten und die Überlebensrate infizierter und nicht infizierter Drohnen verglichen. Wir untersuchten auch, ob Männchen in der Lage sind, ihre Fortpflanzungsorgane und ihr Ejakulat vor N. apis-Infektionen zu schützen, um das Risiko der Übertragung infektiöser Sporen während der Kopulation zu minimieren. Dazu haben wir die Auswirkungen einer N. apis-Infektion auf die Fortpflanzungsorgane der Drohnen in verschiedenen Altersstufen gemessen und die Folgen einer solchen Infektion auf ihre Fruchtbarkeit quantifiziert.

Um N. apis-Sporen zu sammeln, beprobten wir 20 Futterarbeiter aus fünf verschiedenen mit N. apis infizierten Honigbienenvölkern an der University of Western Australia und froren alle 100 Bienen, die wir beprobt hatten, zwei Stunden lang bei -20 °C ein. Wir haben ihre Mitteldärme herausgeschnitten, sie in einem Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml DDI-Wasser und einer 3-mm-Wolframperle (Qiagen, Australien) gepoolt und sie in einer Mischmühle (Retsch MM301, Australien) 30 s lang bei 25 Hz homogenisiert. Als nächstes schichteten wir 0,5 ml des Homogenats auf 1,5 ml 100 % Percoll (Sigma-Aldrich, Australien) in einem 2-ml-Eppendorf-Röhrchen und zentrifugierten es 60 Minuten lang bei 4 °C und 18.000 xg und verwarfen den Überstand. Das Pellet mit den N. apis-Sporen wurde mit 1,5 ml DDI-Wasser resuspendiert. Die Probe wurde kurz gevortext und erneut 5 Minuten lang bei 20.700 xg zentrifugiert. Wir wiederholten diesen Vorgang dreimal, bevor wir das endgültige Pellet in 0,5 ml DDI-Wasser resuspendierten, um es bei -80 °C zu lagern. Vor der Infektion der Drohnen haben wir die Probe aufgetaut und mit Zuckersirup auf eine Endkonzentration von 10.000 Sporen/μL verdünnt. Unsere früheren Arbeiten haben gezeigt, dass das Sammeln von N. apis-Sporen wie oben beschrieben die Auswirkungen auf ihre Lebensfähigkeit minimiert25.

Im Sommer 2010 züchteten wir Drohnen in zwei verschiedenen Bienenvölkern gemäß den üblichen Imkereipraktiken, indem wir jeder Kolonie eine leere Drohnenwabe zur Verfügung stellten. Zwei Tage vor dem Schlüpfen stellten wir die Drohnenrahmen in einen Inkubator bei 33 °C und 90 % Luftfeuchtigkeit und sammelten die Drohnen am Tag ihres Auftauchens (Tag 0). Die ersten 21 gesammelten Drohnen wurden für die folgenden Verfahren verwendet: Der Kot von drei frisch geschlüpften Drohnen wurde unter einem Mikroskop auf das Vorhandensein von N. apis-Sporen untersucht. Als nächstes haben wir 6 frisch geschlüpfte Drohnen zwei Stunden lang durch Gefrieren getötet, um ihre Mitteldärme herauszuschneiden und das Darmgewebe mikroskopisch auf Anzeichen einer N. apis-Infektion zu untersuchen. Während der Sektionen stellten wir fest, dass ihr Mitteldarm durchscheinend war und konnten keine Anzeichen einer N. apis-Infektion, wie etwa Sporen oder morphologische Veränderungen, feststellen. Darüber hinaus haben wir sechs frisch geschlüpfte Drohnen durch Einfrieren getötet, um histologische Proben durch Einbettung ihrer Sexualorgane (Hilfsdrüsen und Hoden) vorzubereiten und sie auf Anzeichen einer Infektion mit N. apis zu untersuchen. Schließlich haben wir weitere 6 frisch geschlüpfte Drohnen eingefroren, um mithilfe von Mikrosatellitenmarkern das Vorhandensein oder Fehlen von N. apis-DNA zu bestimmen. Da wir bei keinem der 21 untersuchten frisch geschlüpften Männchen Anzeichen von N. apis entdeckten (Tabelle 1), kamen wir zu dem Schluss, dass frisch geschlüpfte Männchen nicht mit N. apis infiziert waren, was mit der Literatur übereinstimmt26.

Alle verbleibenden schlüpfenden Drohnen wurden gesammelt und jeweils mit 1 μl (10.000 Sporen) N. apis-Sporenlösung (hergestellt wie oben beschrieben) gefüttert, bevor wir sie in ihre mütterlichen Kolonien zurückbrachten. Wir fingen jeweils 21 Drohnen am 6., 9., 13., 15., 20. und 25. Tag nach der Infektion ein und verwendeten sie für die gleichen Experimente wie oben beschrieben: 3 Drohnen wurden sofort auf Sporen in ihren Fäkalien untersucht, 6 Drohnen wurden durch Gefrieren getötet Sie sezierten und inspizierten ihre Mitteldärme, 6 Drohnen wurden zur histologischen Einbettung und Inspektion ihrer Geschlechtsorgane eingesetzt und 6 Drohnen wurden mithilfe von Mikrosatellitenmarkern auf N. apis-DNA überprüft. Um außerdem zu untersuchen, ob geschlechtsreife Drohnen in der Lage wären, N. apis-Sporen während der Paarung auf die Königin zu übertragen, untersuchten wir mikroskopisch die Ejakulate von drei infizierten Drohnen an den Tagen 13, 15, 20 bzw. 25 Tage nach der Infektion. Eine Übersicht über die für jedes Experiment verwendeten Stichprobengrößen finden Sie in Tabelle 1.

Nachdem wir wie oben beschrieben 6 Drohnen für jede der 7 Altersgruppen eingesammelt und eingefroren hatten, sezierten wir ihre Fortpflanzungsorgane (Nebendrüsen und Nebenhoden). Um eine Kontamination zu vermeiden, haben wir alle Geräte nach jeder Präparation mit Ethanol, Bleichmittel und Wasser gereinigt27. Darüber hinaus spülten wir jede Gewebeprobe dreimal vor der histologischen Einbettung in Hayes-Lösung (0,15 M NaCl, 1,80 mM CaCl2, 2,68 mM KCl, 1,19 mM NaHCO3, eingestellt auf pH 8,7 mit NaOH, filtriert (0,22 μm Millex® GP-Filtereinheit, Als nächstes überführten wir jede Probe in ein 2-ml-Röhrchen und bedeckten es mit 1,8 ml kaltem Fixiermittel (2,5 % Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd), bevor wir es 30 Minuten lang auf Eis bei 10 U/min auf einen Stovall Belly Dancer TM Shaker stellten Über Nacht bei 4 °C in einer dunklen Box. Anschließend überführten wir die Proben in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,4 und mischten sie 15 Minuten lang auf Eis auf einem Belly Dancer bei 10 U/min. Als nächstes gaben wir sie in 1 % Osmiumtetroxid (Sigma- Alderich, Australien) für 2 Stunden, bevor wir sie in Phosphatpuffer spülten. Um die Gewebeproben zu dehydrieren, platzierten wir sie zunächst in einer aufsteigenden Reihe von Ethanolkonzentrationen (50, 70, 90 und 100 %), gefolgt von zwei Wäschen in Propylenoxid und Einbettung in Epon Procure 812-Araldite-Harz (Polyscience, Inc., Australien) unter Verwendung von vier Schritten zunehmender Konzentrationen von Propylenoxid-zu-Harz-Verhältnissen (1:3, 1:1: 3:1 und reines Harz), alle gemäß den Angaben des Herstellers Protokoll. Schließlich legten wir jede Gewebeprobe über Nacht bei 60 °C in Formen mit Harz. Alle eingebetteten Organe wurden mit Glasmessern unter Verwendung eines Ultramikrotoms (LKB) geschnitten. Die 1–2 μm großen Abschnitte wurden dann 5 Minuten lang mit einer gealterten, gesättigten Lösung von Natriumhydroxid in 100 % Ethanol (Natriumethoxid) entplastifiziert. Anschließend spülten wir sie jeweils 10 Sekunden lang in 100 % Ethanol und Wasser, bevor wir sie 7,5 Minuten lang in 1 % w/v Wasserstoffperoxid einlegten. Abschließend spülten wir jeden Abschnitt 3 Sekunden lang unter Leitungswasser und färbten ihn mit Slideder's Hämatoxylin, Eosin und 1 % w/v Biebrich Scarlet28. Zuletzt haben wir die Schnitte mit wasserfreien Eindeckmedien (Entellan®, Merkck Millipore, Australien) auf Objektträger montiert und sie unter einem Olympus BX51-Mikroskop (Hellfeld von Olympus, Japan, Namarski-Optik mit UPLAN FL-Objektiven) untersucht und digitale Fotos gemacht mit einer Olympus DP70 Kamera.

Wir verwendeten spezielle Primer, um das Vorhandensein von N. apis in den Fortpflanzungsorganen der Drohnen zu testen. Dazu haben wir die Nebendrüsen und Nebenhoden von 6 Drohnen pro Altersgruppe präpariert (siehe Tabelle 1) und sie in Hayes-Lösung gespült. Um DNA zu extrahieren, legten wir jede Probe in 95 %iges Ethanol, bevor wir sie in ein Fläschchen mit 500 μl Extraktionspuffer (0,1 M Tris, 0,05 M EDTA, 0,5 M NaCl, 1 % w/v Polyvinylpyrrolidon) und einem 3-mm-Wolfram überführten Perle (Qiagen, Australien). Nachdem wir jede Probe 3 Minuten lang in einer Mischmühle bei 25 Hz homogenisiert hatten, fügten wir 66 μl 10 %iges Natriumdodecylsulfat hinzu, bevor wir 15 Minuten lang bei 20.800 xg und 4 °C zentrifugierten. Wir fügten 445 μl Isopropanol zu 600 μl des Überstands hinzu und inkubierten die Proben 15 Minuten lang auf Eis, bevor sie 15 Minuten lang bei 20.800 xg und 4 °C zentrifugiert wurden. Wir haben das DNA-Pellet in 500 μl 70 %igem Ethanol resuspendiert und jede Probe erneut 15 Minuten lang bei 20.800 xg und 4 °C zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstands wurde jedes Pellet 20–45 Minuten lang an der Luft getrocknet, bevor es in 100 μl DDI-Wasser resuspendiert und erneut 15 Minuten lang bei 20.800 xg und 4 °C zentrifugiert wurde. Wir haben den Überstand gesammelt und die DNA-Menge mit einem NanoDrop (ND-1000 V3.2.1., Amerika) bestimmt. Vor der PCR haben wir jede Probe in DDI-Wasser auf eine Endkonzentration von 50 ng DNA/μL verdünnt.

Wir verwendeten N. apis-Primersequenzen, wie in der Literatur29 veröffentlicht, erworben von Sigma-Alderich, Australien. Der verwendete Vorwärtsprimer war 5-GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA-3 und der Rückwärtsprimer war 5-GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG-3. Wir haben DNA in einem S1000™ Thermal Cycler Chassis (Bio Rad, Australien) amplifiziert. Jede Reaktion enthielt 13,4 μl steriles DDI-Wasser, 2 μl 10x Taq-Puffer, 0,1 μl Taq-Polymerase (Bio-Rad, Australien, Kat.-Nr. M0267X), 1,0 μl jedes Vorwärts- und Rückwärtsprimers, 0,2 μl 10 % Triton-x100, 0,5 μL dNTP (Bio-Rad, Australien, Kat.-Nr. 0447 L) und 2 μL extrahierte DNA oder steriles DDI-Wasser als Negativkontrolle. Wir denaturierten die DNA 5 Minuten lang bei 94 °C (1x Zyklus); Darauf folgten 30 Reaktionszyklen, bestehend aus Denaturierung für 15 s bei 94 °C, Primer-Annealing für 30 s bei 61,8 °C, Verlängerung für 45 s bei 72 °C; und ein abschließender Verlängerungszyklus von 7 Minuten bei 72 °C (1x Zyklus).

Um das Fehlen oder Vorhandensein von N. apis-DNA in jeder Probe zu bestätigen, ließen wir 5 μl des PCR-Amplifikationsprodukts auf 1 %igen Agarosegelen (Promega, Australien) in 1x Tris-Borat-EDTA-Puffer mit 2 % v/v laufen Elektrophorese Ethidiumbromid (Merck, Australien). Wir verwendeten eine 100-bp-DNA-Leiter (Invitrogen, Australien, Kat.-Nr. 15628-019) als molekularen Marker und eine N. apis-Sporenprobe als Positivkontrolle. Für die Gelelektrophorese verwendeten wir eine Bio Rad Mini-Sub® Cell GT-Zelle (Australien) bei 80 V, 400 mA für 30 Minuten. Anschließend haben wir die Gele in einem Bio Rad ChemiDoc™ XRS + System mit Image Lab™ Software (Australien) fotografiert und das Vorhandensein oder Fehlen von N. apis festgestellt, indem wir jede Probe auf artspezifische Gelbanden überprüft haben.

Im Jahr 2013 führten wir ein zusätzliches Experiment durch, um die Wirkung von N. apis auf das Überleben von Drohnen und die Lebensfähigkeit von Spermien in verschiedenen Altersstufen zu quantifizieren, und züchteten Drohnen in zwei verschiedenen Kolonien, wie oben beschrieben. Nach dem Schlüpfen teilten wir 20–30 Drohnen nach dem Zufallsprinzip einem von 25 Käfigen (14 × 19,5 × 2,3 cm, durchstochenes Metallblech auf der einen Seite und Drohnenschutz auf der anderen Seite) zu und setzten sie für die nächsten 24 Stunden wieder in ihre Mutterkolonien ein. Wir sammelten die Käfige ein und fütterten die Drohnen entweder mit 1 μL Nosema-Sporenlösung (10.000 Sporen) oder mit 1 μL 100 % w/v Zuckersirup als Kontrolle. Infolgedessen hatten wir 12 Käfige mit infizierten Drohnen und 14 Käfige mit nicht infizierten Drohnen. Wir haben die Drohnen 12, 13, 16, 19, 20, 24 und 25 Tage nach der Infektion erneut beprobt. Für jeden Käfig haben wir zunächst alle lebenden und toten Drohnen gezählt, um das Überleben der Drohnen zu quantifizieren. Wir betäubten die überlebenden Drohnen mit Chloroform, um die Ejakulation einzuleiten, und drückten den Bauch der Drohnen vorsichtig zwischen zwei Fingern, bis Sperma an der Spitze des Endophallus erschien30. Um die Lebensfähigkeit der Spermien zu quantifizieren, verwendeten wir die von Paynter et al. beschriebene Durchflusszytometrie. (2014)31. Kurz gesagt, wir sammelten etwa 2 μL Ejakulat pro Drohne in 1 μL Samenverdünnungsmittel (188,3 mM Natriumchlorid, 5,6 mM Glucose, 574,1 nM Arginin, 684,0 nM Lysin, 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 8,7). Wir fügten jeder Samenprobe 1 ml Samenverdünnungsmittel hinzu und vermischten es vorsichtig, indem wir das Fläschchen umdrehten, bis sich das Ejakulat vollständig verteilt hatte. Um zu verhindern, dass Schleim die Kapillare des Durchflusszytometers verstopft, filtrierten wir eine Teilprobe von 200 μl durch ein Nylonnetz mit 50 μm Durchmesser und fügten der gefilterten Probe 800 μl Samenverdünnungsmittel hinzu. Um lebende und tote Spermien unterschiedlich zu färben, verwendeten wir 400 μl Spermienprobe, fügten 2 μl 1 mM SYBR 14-Farbstoff (Invitrogen, Kat.-Nr. L-7011) hinzu und inkubierten es 10 Minuten lang im Dunkeln. Wir fügten 2 μl 2,4 mM Propidiumiodid (PI) (Invitrogen, Kat.-Nr. L-7011) hinzu und inkubierten die Probe 7 Minuten lang im Dunkeln. Die Lebensfähigkeit der Spermien wurde für mindestens 3000 Spermien in einem digitalen Durchflusszytometer BD FACS Canto II (Amerika) quantifiziert. Das Durchflusszytometer zeichnete die SYBR 14-Fluoreszenzemission im Bereich von 515–545 nm und die PI-Fluoreszenzemission im Bereich von 670–735 nm ohne Kompensation der spektralen Überlappung auf. Wir haben die Höhe und nicht die Fläche des von SYBR 14 und PI erzeugten Spannungsimpulses aufgezeichnet, da Honigbienensperma außergewöhnlich lang ist (260 μm)1. Mit SYBR 14 gefärbte Spermien wurden unter Verwendung des FlowJo-Softwarepakets Version 7.6.5 für Windows (TreeStar, USA) als lebend und mit PI gefärbte Spermien als tot eingestuft. Wir haben die Autogate-Funktion der Flowjo-Software verwendet, außer in 10 Fällen, in denen die Populationen lebender und toter Spermien durch die Software nicht getrennt werden konnten. Wie in diesen Fällen üblich, haben wir die Tore daher manuell zugewiesen. Wir ignorierten doppelt gefärbte Zellen, die in sehr geringer Häufigkeit auftraten. Statistische Analysen wurden mit SPSS Version 21 für Macintosh durchgeführt. Das Alter der Drohnen wurde für die Zahlen gruppiert, statistische Analysen wurden jedoch mit dem Alter der Drohnen als Kovariate durchgeführt.

Wir fanden heraus, dass alle mit N. apis-Sporen gefütterten Drohnen folglich eine Infektion entwickelten (Tabelle 1), was wir durch das Vorhandensein morphologischer Veränderungen bestätigen konnten, die im Mitteldarm infizierter Drohnen im Vergleich zu nicht infizierten Drohnen sichtbar wurden (Abb. 1). ). Wir fanden heraus, dass die Mitteldärme frisch geschlüpfter, nicht infizierter Drohnen durchsichtig erschienen und mit zunehmender Reife der Drohnen durchscheinend blieben (Abb. 1A, C). Im Gegensatz dazu entwickelten ihre Mitteldärme mit zunehmender Reife der infizierten Drohnen eine erhebliche Schwellung, verloren ihre Transparenz und veränderten ihre Farbe zu Grauweiß (Abb. 1B, D). Mikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass die Epithelzellen des Mitteldarms infizierter Drohnen mit N. apis-Sporen gefüllt waren (Abb. 2A-C) und wir konnten eine große Anzahl neu freigesetzter Sporen aus geplatzten Zellen beobachten (Abb. 2D).

Vergleich der Mitteldärme reifer männlicher Honigbienen, die entweder nicht infiziert waren (A = grobe Morphologie und C = vergrößert) oder mit dem mikrosporidischen Parasiten Nosema apis infiziert waren (B = grobe Morphologie und D = vergrößert).

Verschiedene Ansichten des Mitteldarms und des Kots reifer Honigbienenmännchen, die mit dem mikrosporidischen Parasiten Nosema apis infiziert sind: A = Mitteldarm 20 Tage nach der Infektion, B = vergrößerte Ansicht eines infizierten Mitteldarms, C = Nahaufnahme der Epithelzellen eines infizierten Mitteldarms. D = Kot mit Taschen aus Sporenmassen (innerhalb des weißen Randes) unter anderen Trümmern (braun).

Beim Vergleich der präparierten akzessorischen Drüsen und akzessorischen Hoden infizierter und nicht infizierter Drohnen (Abb. 3) fanden wir keine der oben beschriebenen morphologischen Anzeichen einer Infektion für das Mitteldarmgewebe (Abb. 1 und 2). Darüber hinaus fanden wir in den Geschlechtsorganen infizierter Drohnen jeden Alters nie N. apis-Sporen, weder im Gewebe noch im Lumen, das Sperma oder Samenflüssigkeit enthielt. Diese Beobachtung wurde histologisch bestätigt, als man die Sexualtrakte nicht infizierter und infizierter Drohnen unterschiedlichen Alters vergleichte. Wir fanden heraus, dass das Muskelgewebe, das die akzessorische Drüse und ihre Epithelzellschicht umgibt, mit zunehmendem Alter der Drohne allmählich degenerierte (Abb. 3), was für das Muskelgewebe, das die akzessorischen Hoden umgibt, nicht der Fall war (Abb. 3). Allerdings zeigten weder die akzessorischen Drüsen noch das akzessorische Hodengewebe sichtbare Anzeichen einer Infektion (Abb. 3). Darüber hinaus fanden wir trotz einer sehr sorgfältigen mikroskopischen Untersuchung sowohl der Nebenhoden als auch der Nebendrüsen bei keinem der infizierten Männchen eine einzige N. apis-Spore. Unsere PCR-Analyse wies jedoch N. apis-DNA in männlichen Fortpflanzungsgeweben nach (Abb. 4). Dies war bei allen Drohnen-Altersgruppen der Fall, mit Ausnahme der neu aufgetauchten Drohnen, was bestätigt, dass neu geschlüpfte Drohnen nicht mit N. apis infiziert sind. Als wir schließlich ejakuliertes Sperma mikroskopisch untersuchten, waren N. apis-Sporen nur bei Drohnen im Alter von 20 und 25 Tagen vorhanden (Abb. 5), jedoch nie bei jüngeren Drohnen im Alter von 9, 13 oder 15 Tagen.

Vertikale Längsschnitte durch die akzessorischen Hoden (oben) und die akzessorische Drüse (unten) männlicher Honigbienen 0, 13 und 20 Tage nach der Infektion (pi) mit dem mikrosporidischen Pilzparasiten Nosema apis.

PCR-Amplifikationsergebnisse zeigen DNA des mikrosporidischen Parasiten Nosema apis im Fortpflanzungsgewebe infizierter, ausgewachsener männlicher Honigbienen. Abkürzungen: AG = akzessorische Drüsen, AT = akzessorische Hoden, Eja = Ejakulat, -ve-Kontrolle = Wasser als Negativkontrolle, +ve-Kontrolle = Proben, von denen bekannt ist, dass sie Nosema-apis-DNA enthalten, die als Positivkontrolle verwendet werden.

Selbstejakuliertes Sperma eines 20 Tage alten Honigbienenmännchens, das mit dem mikrosporidischen Parasiten Nosema apis infiziert ist. Es zeigt Spermien- und Schleimpartikel sowie Fortpflanzungssporen des Parasiten.

Für 49 infizierte und 60 nicht infizierte Männer standen Daten zur Spermienlebensfähigkeit zur Verfügung. Wir fanden heraus, dass das Überleben von Drohnen mit zunehmendem Alter signifikant abnahm (ANCOVA, P < 0,001, siehe Tabelle 2 für statistische Details, Abb. 6 A). Es gab einen signifikanten Effekt der N. apis-Infektion auf die männliche Mortalität, was durch ein signifikantes Behandlungs-x angezeigt wurde Altersinteraktion (ANCOVA, df = 1, P = 0,013, Abb. 6 A). Das Überleben der Drohnen war bei infizierten und nichtinfizierten Drohnen ähnlich, bis sie ein Alter von etwa 16 Tagen erreichten. Danach stieg die Sterblichkeit bei infizierten Drohnen im Vergleich zur Kontrollbehandlung erheblich an. Paarweise Post-hoc-t-Tests unter Verwendung von Altersgruppen ergaben, dass ein deutlich geringerer Anteil der behandelten Drohnen (20,7 %) pro Käfig das Alter von 24 bis 25 Tagen überlebte im Vergleich zu Kontrolldrohnen (54,7 %), mit t = 3,5, df = 6 und p = 0,013. Die Ergebnisse der Post-hoc-Tests für die anderen Altersgruppen waren nicht signifikant.

Vergleich von Honigbienenmännchen in verschiedenen Altersgruppen, die entweder mit Sporen von Nosema apis (infiziert) oder Zuckersirup (Kontrolle) gefüttert wurden: A) Prozentsatz des Drohnenüberlebens pro Käfig, Zahlen in Balken beziehen sich auf die Anzahl der jeweils verwendeten Käfige Altersgruppe (20–30 Bienen pro Käfig) B) Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Spermien pro Ejakulat. Die Zahlen innerhalb der Balken geben die Anzahl der verwendeten Drohnen für jede Altersgruppe an.

In ähnlicher Weise nahm auch die Lebensfähigkeit der Spermien mit zunehmendem Alter des Mannes ab (ANCOVA, P = 0,003, statistische Details siehe Tabelle 3, Abb. 6 B). Wir fanden auch einen signifikanten Wechselwirkungsterm zwischen Behandlung und Alter, was darauf hindeutet, dass infizierte Männer ihre Fruchtbarkeit schneller verloren als Kontrolldrohnen (ANCOVA, P = 0,013, siehe Tabelle 3). Die Ergebnisse einzelner paarweiser Post-hoc-T-Tests anhand von Altersgruppen waren nicht signifikant.

Unsere Experimente ergaben, dass N. apis in der Lage ist, Drohnen zu infizieren, und dass sich diese Infektionen so stark anhäuften, dass sie den Männchen erhebliche Kosten verursachten. Wir fanden eine Verringerung der Fruchtbarkeit und Lebensdauer mit zunehmendem Alter der Drohnen (Abb. 6) sowie eine Kontamination des Ejakulats infizierter Drohnen mit Sporen (Abb. 4). Honigbienendrohnen werden ab 12 Tagen nach dem Schlüpfen geschlechtsreif und behalten somit ihr maximales Fruchtbarkeitspotenzial über einen Zeitraum von etwa 10 Tagen32. Während dieser Zeit nehmen sie an Hochzeitsflügen teil, um jungfräuliche Königinnen zu finden und sich mit ihnen zu paaren. Die phänotypische Ausprägung einer N. apis-Infektion wie Sporen im Ejakulat und eine Verringerung der Fruchtbarkeit und des Überlebens der Drohnen wirken sich daher auf diese Drohnen während ihrer Hauptreproduktionsperiode aus. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Drohnen, die sich kurz nach dem Schlüpfen infizieren, letztendlich mit erheblichen Fitnesskosten zu kämpfen haben und im Falle einer Paarung eine Infektionsgefahr für jungfräuliche Königinnen darstellen. Es wäre daher interessant zu untersuchen, ob infizierte Drohnen tatsächlich ihre Kolonien für Hochzeitsflüge verlassen und wenn ja, ob ihr Paarungserfolg im Vergleich zu dem nicht infizierter Männchen beeinträchtigt ist. Aus Sicht einer Kolonie könnten sich infizierte Männchen dafür entscheiden, nicht an Paarungsflügen und Paarungen teilzunehmen, um den Paarungserfolg ihrer nicht infizierten Brüder nicht zu gefährden. Eine solche „altruistische“ Selbstentziehung wurde bei Honigbienenarbeitern nach längerer CO2-Narkose oder nach Fütterung mit dem Zytostatikum Hydroxyharnstoff berichtet. Beide Behandlungen erhöhten die Sterblichkeit der Arbeiter und die überlebenden Sammler verließen ihre Kolonien und begingen faktisch altruistischen Selbstmord33. Eine solche Selbstentfernung ist auch von anderen sozialen Insekten bekannt34. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um das Risiko einer vertikalen Übertragung durch mit N. apis infizierte Männer zu quantifizieren.

Obwohl unsere visuellen Untersuchungen, sowohl morphologisch als auch histologisch, keine offensichtlichen Anzeichen von N. apis-Infektionen in Fortpflanzungsgeweben oder deren Produkten ergaben, kann DNA von N. apis sowohl in akzessorischen Drüsen als auch akzessorischen Hoden nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass N. apis in der Lage ist, geringe Infektionsraten im Fortpflanzungsgewebe von Drohnen zu etablieren. Da wir jedoch in keinem der von uns untersuchten Fortpflanzungsgewebe Sporen fanden, scheint der Erreger nicht in der Lage zu sein, seinen Fortpflanzungszyklus abzuschließen oder eine Infektion aufzubauen. Obwohl N. apis in der Lage ist, akzessorische Hoden und akzessorische Drüsen von Drohnen zu infizieren, scheinen die Drohnen daher in der Lage zu sein, die Sporenproduktion dieses Parasiten in ihrem Fortpflanzungsgewebe zu verlangsamen oder zu verhindern, wodurch das Risiko einer sexuellen Übertragung verringert wird. Dies ist ein interessanter Befund, da bereits bekannt ist, dass N. apis-Infektionen sich auf verschiedene Organe von Honigbienen ausbreiten, beispielsweise auf den Fettkörper, die Malpigiantubuli oder die Hämolymphe35. Im Vergleich dazu wurde berichtet, dass Nosema ceranae Drohnen bereits im Puppenstadium infiziert36, das Körpergewicht und die Lebensdauer der Drohnen verringert und physiologische Veränderungen bei Honigbienenköniginnen hervorruft37. Obwohl Drohnen anfälliger für N. ceranae sind als Arbeiter, sollten sie bei speziell ausgewählten Honigbienenstämmen eine höhere Toleranz gegenüber N. ceranae entwickeln38. Es wäre daher interessant zu untersuchen, wie Männer ihr Fortpflanzungsgewebe schützen können und ob die Kosten, die mit der Unterdrückung von N. apis-Infektionen verbunden sind, zu der beobachteten Verringerung der Lebensfähigkeit der Spermien und des männlichen Überlebens führen.

Wir haben N. apis-Sporen im Sperma älterer Drohnen gefunden, was die Frage aufwirft, wie sie das Ejakulat kontaminieren konnten. Unsere Sektionsarbeit ergab, dass N. apis erhebliche Schäden an Geweben wie dem Mitteldarm verursacht, der mit zunehmendem Alter immer fragiler wird und leicht beschädigt werden kann. Darüber hinaus ist bekannt, dass N. apis bei Honigbienen Ruhr verursacht, was zu sporenhaltigen Fäkalienrückständen auf den Bienen führt39,40. Es ist daher möglich, dass die von uns im Ejakulat älterer Drohnen entdeckten Sporen entweder durch fäkale Kontaminationen des Endophallus oder durch Blutungen nach Gewebeschäden verursacht werden. Die Ejakulation ist ein traumatischer Prozess, da die Drohne ihre Bauchmuskeln anspannt, um einen Hämolymphdruck aufzubauen, der den irreversiblen Ausstoß des Endophallus und dann des Ejakulats auslöst. Während eines letzten Schritts der Ejakulation platzt die Spitze des Endophallus der Drohnen, bricht ab und verbleibt nach der Kopulation in der Königin41, was zum Tod der Drohnen führt. Daher liegt die Annahme nahe, dass infizierte Gewebe, die ohnehin anfälliger für Schäden und Risse sind, unter dem oben beschriebenen Druckaufbau N. apis-Sporen freisetzen, was zu einer Sporenkontamination des Ejakulats führt. Weitere experimentelle Arbeiten sind erforderlich, um diese naheliegenden Mechanismen aufzuklären. Treten jedoch während des Ejakulationsprozesses Infektionen auf, müsste die einzige Gegenmaßnahme eines Mannes zum Schutz seines Ejakulats und seines Partners aus den im Ejakulat vorhandenen Immunmerkmalen abgeleitet werden. Interessanterweise bestehen Drohnenejakulate nicht nur aus Sperma, sondern auch aus erheblichen Mengen Samenflüssigkeit, die von den Nebendrüsen produziert wird1,42. Letzteres ist biochemisch komplex und enthält eine Reihe von Immunproteinen, einige davon mit bekannten antimykotischen Eigenschaften wie Chitinase43. Weitere Untersuchungen sollten daher die Idee testen, dass Samenflüssigkeit N. apis-Sporen abtöten kann, um das Risiko einer Infektion durch N. apis innerhalb der Königin zu minimieren.

Zitierweise für diesen Artikel: Peng, Y. et al. Folgen einer Nosema apis-Infektion für männliche Honigbienen und ihre Fruchtbarkeit. Wissenschaft. Rep. 5, 10565; doi: 10.1038/srep10565 (2015).

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Die Autoren würdigen die Einrichtungen und die wissenschaftliche und technische Unterstützung der Australian Microscopy & Microanalysis Research Facility am Centre for Microscopy, Characterization & Analysis der University of Western Australia, einer von der Universität, den Bundesstaaten und den Commonwealth-Regierungen finanzierten Einrichtung. Wir danken auch den folgenden Personen, die an der University of Western Australia arbeiten, aufrichtig: Thomas Stewart und Michael Archer für ihre Unterstützung bei der Histologie, Elke Ströher und Tiffane Bates für ihre technische Unterstützung und Julia Grassl für ihren intellektuellen Beitrag. Diese Arbeit wurde durch zwei vom Australian Research Council angebotene Future Fellowships (an BB und AHM) und ein ARC Linkage Project (an BB und AHM) finanziert. Die Rural Industries Research and Development Corporation stellte ein Doktorandenstipendium zur Verfügung, um Yan Peng zu unterstützen.

Zentrum für integrative Bienenforschung (CIBER), Bayliss Building M316, The University of Western Australia, Crawley, WA 6009, Australien

Yan Peng, Barbara Baer-Imhoof & Boris Baer

ARC Centre of Excellence in Plant Energy Biology, Bayliss Building M316, The University of Western Australia, Crawley, WA 6009, Australien

A. Harvey Millar

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YP und BBI führten die Experimente durch, analysierten die Daten und trugen zum Schreiben der Arbeit bei, AHM und BB überwachten die Arbeit, analysierten die Daten und verfassten die Arbeit. Alle Autoren überprüften das Manuskript und stimmten seiner Einreichung zu.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Peng, Y., Baer-Imhoof, B., Harvey Millar, A. et al. Folgen einer Nosema apis-Infektion für männliche Honigbienen und ihre Fruchtbarkeit. Sci Rep 5, 10565 (2015). https://doi.org/10.1038/srep10565

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Eingegangen: 21. November 2014

Angenommen: 14. April 2015

Veröffentlicht: 30. Juni 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep10565

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