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Jul 08, 2023

SARS

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 65 (2023) Diesen Artikel zitieren 1505 Zugriffe auf 14 Altmetric Metrics-Details Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch schwere akute Atemwegserkrankungen verursacht wird

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 65 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, hat sich zu einer weltweiten Pandemie mit über 627 Millionen Fällen und über 6,5 Millionen Todesfällen entwickelt. Es wurde berichtet, dass eine rauchbedingte chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ein entscheidendes Risiko für die Entwicklung einer schweren Erkrankung bei COVID-19-Patienten darstellen könnte. Da Zigarettenrauch (CS) der Hauptrisikofaktor für COPD ist, nehmen wir an, dass eine Barrierefunktionsstörung und eine veränderte Zytokinreaktion in CS-exponierten Atemwegsepithelzellen zu einer erhöhten SARS-CoV-2-induzierten Immunantwort beitragen können, die zu einer erhöhten Anfälligkeit führen kann zu schweren Erkrankungen. Ziel dieser Studie war es, die Rolle von CS bei SARS-CoV-2-induzierten Immun- und Entzündungsreaktionen sowie der Integrität der Epithelbarriere zu bewerten, die zu einer Schädigung des Atemwegsepithels führt.

Primäre menschliche Atemwegsepithelzellen wurden unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur differenziert. Anschließend wurden die Zellen Zigarettenrauchmedium (CSM) ausgesetzt, bevor sie mit SARS-CoV-2 infiziert wurden, das von einem lokalen Patienten isoliert wurde. Die Infektionsanfälligkeit, Morphologie und die Expression von Genen im Zusammenhang mit der Immunantwort des Wirts, Atemwegsentzündungen und Schäden wurden bewertet.

Mit CSM vorbehandelte Zellen verursachten eine signifikant höhere Replikation von SARS-CoV-2 und eine schwerwiegendere SARS-CoV-2-induzierte zelluläre morphologische Veränderung. Die CSM-Exposition verursachte eine signifikante Hochregulierung des langen Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE)2, eines funktionellen Rezeptors für den Viruseintritt von SARS-CoV-2, der Transmembran-Serinprotease (TMPRSS)2 und TMPRSS4, die das Spike-Protein von SARS-CoV-2 spalten ermöglichen den Eintritt von Viren, was zu einer verstärkten Immunantwort über die Hemmung des Typ-I-Interferon-Signalwegs führt. Darüber hinaus verschlimmerte CSM die durch SARS-CoV-2 verursachte Schädigung der Atemwegsepithelzellen, was zu schweren Störungen der Beweglichkeit der Zilien, Verbindungsstörungen und Schleimhypersekretion führte.

Rauchen führte zu einer Fehlregulation der Immunantwort des Wirts und zu Zellschäden, wie bei SARS-CoV-2-infizierten primären menschlichen Atemwegsepithelien beobachtet. Diese Erkenntnisse können zu einer erhöhten Krankheitsanfälligkeit bei schweren Erkrankungen beitragen und zu einem besseren Verständnis der Pathogenese der SARS-CoV-2-Infektion bei Rauchern führen.

Die anhaltende weltweite Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird, hatte mit über 627 Millionen Fällen und über 6,5 Millionen Todesfällen verheerende Auswirkungen [1]. Das klinische Merkmal von COVID-19 reicht von einer asymptomatischen Infektion der oberen Atemwege bis hin zu einer schweren Lungenentzündung, die mit einem akuten Atemnotsyndrom einhergeht [2]. Da das Verständnis der Pathogenese von COVID-19 jedoch noch begrenzt ist, ist es dringend erforderlich, die Risikofaktoren für schlimmere Folgen zu identifizieren.

Ältere COVID-19-Patienten und Patienten mit Komorbiditäten haben ein höheres Risiko, eine schlechte Prognose und Mortalität zu erleiden [3]. Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), eine der häufigsten Todesursachen weltweit, ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung mit langsamem Fortschreiten und daher sind die meisten Patienten ältere Menschen [4]. Eine Virusinfektion als Komorbidität der COPD erhöhte das Risiko schwerer Exazerbationen [5]. Es wurde berichtet, dass COPD ein entscheidender Risikofaktor für COVID-19-Patienten sein könnte, was zu schwerwiegenden klinischen Folgen und einer erhöhten Zahl von Todesfällen im Krankenhaus führen soll [6, 7]. Zigarettenrauch (CS), als Hauptrisikofaktor für COPD, ist ein potenzieller Risikofaktor für COVID-19, da der Zigarettenrauch weltweit weit verbreitet ist und sich negativ auf die Immunantwort auswirkt, was zu einer höheren Anfälligkeit für die meisten Atemwegsviren führt [8]. Es wurde berichtet, dass CS mit dem negativen Verlauf und den Nebenwirkungen von COVID-19 in Zusammenhang steht, wobei das Risiko einer schweren COVID-19-Erkrankung zunimmt [9,10,11]. Patienten mit Raucheranamnese zeigten unter COVID-19 im Vergleich zu Nichtrauchern schwerwiegendere Symptome [9].

Basierend auf dem Wissen, dass Zigarettenrauchen zu mehreren Atemwegsinfektionen führt und mit relativ schlechten Ergebnissen bei Patienten mit dieser Infektion einhergeht [12], veröffentlichte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) Stellungnahmen, in denen sie davor warnte, dass Rauchen das Risiko und die Schwere von COVID-19 erhöhen kann. 19 im Frühstadium der Pandemie [13]. Viele veröffentlichte Studien haben jedoch eine geringe Prävalenz aktiver Raucher bei hospitalisierten Patienten mit COVID-19 in verschiedenen Ländern wie China, Frankreich und den USA festgestellt [14,15,16]. Obwohl Raucher bei Patienten mit COVID-19 unterrepräsentiert sind, bleibt der Zusammenhang zwischen Rauchen und klinischen Ergebnissen unklar. Usman und Kollegen schlugen vor, dass die aktuell gemeldeten Daten aufgrund der Heterogenität der Studien und der geringen Aussagekraft der Daten fraglich seien und dass nicht auf eine schützende Wirkung des Rauchens geschlossen werden dürfe [17].

Es ist allgemein bekannt, dass SARS-CoV-2 über die Bindung an den Wirtsrezeptor Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) in die Zellen gelangt [18], der auf der apikalen Oberfläche der Atemwegsepithelien des Lungengewebes stark exprimiert wird [19]. ]. Daher ist es theoretisch wahrscheinlich, dass eine erhöhte ACE2-Expression mit einer Erhöhung der SARS-CoV-2-Anfälligkeit korreliert. Derzeit zeigten die meisten Studien eine Hochregulierung der ACE2-Expression nach CS-Exposition und bei Rauchern, während andere keinen signifikanten Unterschied zeigten [20,21,22,23,24]. Es war offensichtlich, dass Nikotin die ACE2-Achse reduzieren könnte, was eine potenzielle pharmakologische Therapie für COVID-19 sein könnte [25, 26]. Daher ist die Auswirkung von CS auf SARS-CoV-2-assoziierte schwere Erkrankungen immer noch umstritten.

Da das Atemwegsepithel die erste Barriere gegen Umweltangriffe wie CS und Virusinfektionen bildet, wurde vermutet, dass die Funktionsstörung der Epithelbarriere mit der Pathogenese der COPD zusammenhängt [27]. Die Rolle des Atemwegsepithels bei der Pathogenese einer SARS-CoV-2-Infektion unter Raucherstatus bleibt jedoch unklar. Wir gehen davon aus, dass eine Barrierefunktionsstörung und eine veränderte Zytokinreaktion in CS-exponierten Atemwegsepithelzellen zu einer erhöhten SARS-CoV-2-induzierten Immunantwort beitragen können, die zu einer erhöhten Anfälligkeit für schwere Erkrankungen führen kann. In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung von CS auf die Anfälligkeit für eine SARS-CoV-2-Infektion, SARS-CoV-2-induzierte zelluläre morphologische Veränderungen, die Immunantwort des Wirts, Verbindungsstörungen, Schleimhypersekretion und Zilienstörungen bei gut differenzierten primären Normalwerten menschliche Bronchialepithelzellen (HBECs) unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur (ALI).

CS, das aus zwei Zigaretten ohne Mundstückfilter (Camel) erzeugt wurde, wurde in 20 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung eingeleitet und als 100 % CSM angesehen, wie zuvor beschrieben [28]. Das CSM wurde gefiltert und standardisiert, indem die Absorption bei einer Wellenlänge von 320 nm mit einem Spektrophotometer (CLARIOstar®, BMG Labtech) gemessen wurde, als OD = 1,1.

Vero-E6-Zellen wurden zur Virusisolierung und Vermehrung von SARS-CoV-2 (hCoV-19/Hong Kong/WHV-HK61-P3/2020, GenBank-Zugangs-ID: OM403304) verwendet. Die ursprünglichen klinischen Proben wurden im Januar 2020 in Hongkong aus dem Nasopharynx- und Rachenabstrich eines Patienten (junger erwachsener Mann) mit bestätigter COVID-19-Erkrankung entnommen und wie zuvor beschrieben isoliert [29, 30]. Die Einverständniserklärung des Patienten wurde eingeholt und die Genehmigung wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Universität Hongkong und der Hospital Authority (Hong Kong West) erteilt (IRB-Genehmigungsnummer: UW 20–862).

Normale primäre HBECs (n = 5; Lonza) wurden auf mit Kollagen beschichteten 12-mm-Transwells mit einer Porengröße von 0,4 μm ausgesät und unter ALI-Kultur für 28 Tage in Medium mit einer 1:1-Mischung aus BEBM (Lonza) und DMEM (Gibco) ergänzt mit 52 µg/ml Rinderhypophysenextrakt, 5 µg/ml Insulin, 10 µg/ml Transferrin, 0,5 µg/ml Hydrocortison, 0,5 ng/ml humaner epidermaler Wachstumsfaktor, 0,5 µg/ml Adrenalin, 1,5 µg/ml Rinderserumalbumin und 15 ng/ml Retinsäure. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. Passagen 3 wurden für Experimente genutzt.

Nach 18-stündigem Hungern wurden die gut differenzierten HBECs 24 Stunden lang nur mit 2 % CSM oder Medium als Kontrolle apikal behandelt. Nach der CSM-Exposition wurden HBECs nach gründlichem Waschen mit SARS-CoV-2 oder einer Scheininfektion (nur Medium als Kontrolle) infiziert, entweder bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,1 für die Virusreplikationskinetik oder bei einer MOI von 2 für die Genanalyse Ausdruck. Zelllysate wurden 24 und 48 Stunden nach der Infektion (hpi) zur Analyse der Genexpression gesammelt. Die Zellen wurden bei 72 hpi in 2,5 % Glutaraldehyd oder 10 % Formalin fixiert und für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bzw. Immunhistochemie (IHC)-Färbung verarbeitet (Zusatzdatei 1: Abb. S1).

Zufällig ausgewählte ALI-Kulturen gut differenzierter HBECs wurden in 2,5 % Glutaraldehyd (Electron Microscopy Sciences) fixiert und zur weiteren Probenverarbeitung an die Electron Microscope Unit der University of Hong Kong geschickt. Die Zellen wurden unter einem Philips CM 100 Transmissionselektronenmikroskop beobachtet.

In Harz eingebettete Proben wurden mit 50 %igem Natriumethoxid und abgestuftem Ethanol geätzt. Nach dem Blockieren mit 3 % H2O2 wurden die Objektträger mit 2 % normalem Pferdeserum blockiert und mit primärem Antikörper gegen SARS-CoV-2-Nukleoprotein (#40,143-T62, Sino Biological, 1:100-Verdünnung) inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte mit Impress HRP Horse anti-Rabbit IgG (Vector Labs) mit dem ImmPACT NovaRED Substrate Kit (Vector Labs) entwickelt und mit Toluidinblau gegengefärbt.

Gut differenzierte HBECs wurden für die RNA-Extraktion mit dem MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Takara) geerntet und die reverse Transkription von RNA wurde mit dem EvoScript Universal cDNA Master Kit (Roche) durchgeführt. Der quantitative RT-PCR-Assay wurde mit SYBR Green Real-Time Master Mix (Applied Biosystems) durchgeführt. Alle Verfahren wurden gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Handbüchern durchgeführt. Die relative Menge an mRNA wurde unter Verwendung der vergleichenden Ct-Methode erhalten und durch Housekeeping-Gene wie das menschliche ribosomale Protein S13 wie zuvor beschrieben normalisiert (31). Die verwendeten Primer sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt.

Zellkulturüberstände von der apikalen Oberfläche der Zellen wurden bei 24 und 48 hpi gesammelt, um die Proteinkonzentration von Interleukin (IL)-6 unter Verwendung eines Cytmetric Bead Array (BD Bioscience) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu ermitteln. Der IL-6-Spiegel wurde mit der FCAP Array Analysis Software (BD Bioscience) analysiert.

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Zum Vergleich mehrerer Gruppen wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test mit Post-hoc-Analyse (Tukey) angewendet. Gegebenenfalls wurde auch der Student-T-Test für Variablen implementiert, die zu einem einzigen Zeitpunkt gemessen wurden. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) durchgeführt. Signifikanz wurde erreicht, wenn der p-Wert weniger als 0,05 betrug.

Schwerwiegendere Zellschäden, die durch eine SARS-CoV-2-Infektion hervorgerufen wurden, wurden nach CSM-Exposition (Abb. 1A) beobachtet, die mittels TEM untersucht wurde, wobei geschwollene Vesikel beobachtet wurden. Eine SARS-CoV-2-Infektion verursachte einen Anstieg der Anzahl vergrößerter Vesikel (Abb. 1A). Nach CSM-Exposition wurde auch eine durch SARS-CoV-2 induzierte Degeneration der Mitochondrien festgestellt (Abb. 1A). Obwohl es keinen signifikanten Unterschied in der Replikationskinetik gibt, gemessen durch 50 % Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50)-Titrationen aus dem apikalen Waschen der gut differenzierten Epithelzellen (zusätzliche Datei 1: Abb. S2), ist die IHC-Färbung für SARS-CoV-2-Nukleoprotein zeigte eine höhere Anzahl von Zellen mit positiver Färbung für virales Antigen (rotbraun) in den gut differenzierten Epithelzellen nach CSM-Exposition bei MOI 0,1, was auf eine Zunahme der Virusanfälligkeit hindeutet (Abb. 1B). Wir haben außerdem die ORF-1b-Expression des viralen Gens bei 24, 48 hpi bei MOI 2 gemessen. Die Expression von ORF-1b war nach CSM-Exposition bei 24 hpi signifikant höher. Im Gegenteil, die Expression von ORF-1b auf CSM-exponierten Zellen war mit 48 hpi deutlich geringer als bei einer alleinigen Infektion, was auf eine schnelle Wirkung von CS auf die SARS-CoV-2-Infektion schließen lässt, die möglicherweise auf die Toxizität der Infektion für den Wirt zurückzuführen ist Zellen (Abb. 1C).

Einfluss von Zigarettenrauch auf SARS-CoV-2-induzierte morphologische Veränderungen und Anfälligkeit für SARS-CoV-2-Infektionen in Atemwegsepithelzellen. A Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen gut differenzierter normaler menschlicher Bronchialepithelzellen (MOI = 0,1). m: Mitochondrien; Vesikel sind rote Pfeile. Maßstabsbalken, 2 μm. B Repräsentative Bilder einer immunhistochemischen Färbung mit einem polyklonalen Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Nukleoproteinprotein (MOI = 0,1). Positive Zellen sind rotbraun (schwarze Pfeile). Maßstabsbalken, 50 μm. C-mRNA-Expression des viralen Gens ORF1b (MOI = 2). Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n = 5) ausgedrückt. **p < 0,01 für den ungepaarten Student-T-Test. Strg, Kontrolle; CSM, Zigarettenrauchmedium; SCoV2, SARS-CoV-2; H, Stunden

ACE2 ist, wie bereits beschrieben, der Bindungsrezeptor für SARS-CoV-2. Wir haben gezeigt, dass die gesamte ACE2-mRNA-Expression nach CSM-Exposition bei 24 hpi hochreguliert war, jedoch nicht bei 48 hpi, ohne signifikante Auswirkungen auf die SARS-CoV-2-Infektion (Abb. 2A). ACE2 wurde kürzlich im Atemwegsepithel in kurze und lange Formen unterteilt, wobei die kurze Form ACE2 aufgrund des Fehlens hochaffiner SARS-CoV-2-Spike-Bindungsstellen nicht in der Lage war, das Virus zu binden [32]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Expression der langen ACE2-mRNA nach CSM-Exposition ohne Beeinträchtigung der Infektion sowohl bei 24 als auch bei 48 hpi signifikant höher war und nach einer SARS-CoV-2-Infektion bei 24 hpi weiter hochreguliert war (Abb. 2B). Im Gegensatz dazu wurde nach CSM-Exposition zu beiden Zeitpunkten kein signifikanter Unterschied in der ACE2-mRNA-Kurzform-Expression beobachtet (Abb. 2C). Die Transmembran-Serin-Protease (TMPRSS) 2, die das Spike-Protein von SARS-CoV-2 spaltet, fördert den Eintritt des Virus in die Zellen [18]. Die CSM-Exposition oder die SARS-CoV-2-Infektion selbst regulierten die Expression von TMPRSS2-mRNA auf 24 hpi hoch. Nach einer Virusinfektion in CSM-exponierten Zellen wurde ein Trend zu einer weiteren Induktion beobachtet. Allerdings gab es bei 48 hpi keine signifikanten Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen (Abb. 2D). Die Bedeutung von TMPRSS4 mit ähnlicher Funktion wie TMPRSS2 bei Virusinfektionen wurde bei Rauchern und sein Zusammenhang mit COVID-19 vermutet [20]. Die Expression von TMPRSS4-mRNA war nach CSM-Exposition erhöht, was durch eine SAR-CoV-2-Infektion bei 24 hpi unterdrückt wurde. Bei 48 hpi wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen beobachtet (Abb. 2E).

Wirkung von Zigarettenrauch auf die SARS-CoV-2-induzierte ACE2- und Serinprotease-Expression. Eine mRNA-Expression von Gesamt-ACE2. B-mRNA-Expression der Langform ACE2. C-mRNA-Expression der Kurzform ACE2. D-mRNA-Expression von TMPRSS2. E-mRNA-Expression von TMPRSS4. Strg, Kontrolle; CSM, Zigarettenrauchmedium; SCoV2, SARS-CoV-2; H, Stunden. MOI von 2 wurde zur Analyse der Genexpression verwendet. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n = 5) ausgedrückt. *p < 0,05, **p < 0,01 für den einfaktoriellen ANOVA-Test mit Post-hoc-Analyse und Tukey-Korrektur

Die IFN-β-mRNA-Expression von Typ-I-Interferon (IFN) war nach einer SARS-CoV-2-Infektion sowohl bei 24 als auch bei 48 hpi signifikant hochreguliert, während CSM-behandelte Zellen die SARS-CoV-2-induzierte IFN-β-mRNA-Expression bei 24 hpi inhibierten (Abb. 3A). Die Expression von IFNs vom Typ III sowie der IL-28- und IL-29-mRNA-Expression wurde durch eine SARS-CoV-2-Infektion sowohl bei 24 als auch bei 48 hpi ebenfalls signifikant erhöht, während CSM keinen signifikanten Effekt auf SARS-CoV-2-induziertes IL-28 und IL hatte Es wurden 29 mRNA-Expressionen beobachtet (Abb. 3B und C). Die Expression der mRNA des Interferon-stimulierten Gens 15 (ISG15) und des Myxovirus-Resistenzproteins 1 (MxA), die für die antivirale Reaktion des Wirts essentiell sind, war nach einer SARS-CoV-2-Infektion sowohl bei 24 als auch bei 48 hpi und unter CSM-Exposition signifikant hochreguliert weiter hochregulierte SARS-CoV-2-induzierte ISG15-mRNA-Expression bei 48 hpi (Abb. 3D und E). Die mRNA-Expression von entzündlichen Zytokin-Genen, IL-6, IL-8 und Tumornekrosefaktor α (TNF-α) war nach einer SARS-CoV-2-Infektion oder CSM-Exposition erhöht. Allerdings steigerten CSM-exponierte Zellen die SARS-CoV-2-induzierte Expression von entzündlichen Zytokingenen um 24 hpi weiter. Die IL-6-mRNA-Expression blieb nach einer SARS-CoV-2-Infektion in CSM-exponierten Zellen bei 48 hpi (Abb. 3, FH) erhalten, was mit der Freisetzung von IL-6 an der apikalen Seite der aus der Zelle gesammelten Überstände übereinstimmt Kulturen (Zusatzdatei 3: Abb. S3).

Wirkung von Zigarettenrauch auf die SARS-CoV-2-induzierte Immunantwort. Eine mRNA-Expression von IFN-β. B-mRNA-Expression von IL-28. C-mRNA-Expression von IL-29. D-mRNA-Expression von ISG15. E-mRNA-Expression von MxA. F-mRNA-Expression von IL-6. G-mRNA-Expression von IL-8. H-mRNA-Expression von TNF-α. Strg, Kontrolle; CSM, Zigarettenrauchmedium; SCoV2, SARS-CoV-2; H, Stunden. MOI von 2 wurde zur Analyse der Genexpression verwendet. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n = 5) ausgedrückt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für den einfaktoriellen ANOVA-Test mit Post-hoc-Analyse und Tukey-Korrektur

Normalerweise waren die gut differenzierten Epithelzellen durch Verbindungskomplexe, einschließlich Tight Junctions, Adherens Junctions und Desmosomen, verbunden und bildeten ein dicht gepacktes Epithel ohne Interzellularräume [33]. Unsere TEM-Ergebnisse zeigten, dass die SARS-CoV-2-Infektion nach CSM-Exposition den Tight Junctions- und Adherens Junctions-Komplex vollständig auflöste und in die Zellen eindrang (Abb. 4A). Dies wurde durch den Nachweis des Tight-Junction-Markers Zonula occluden-1 (ZO-1) und des Adherens-Junction-Markers E-Cadherin weiter bestätigt. In CSM-exponierten Zellen regulierte die SARS-CoV-2-Infektion die Expression von ZO-1- und E-Cadherin-mRNA bei 48 hpi weiter herunter (Abb. 4B und C). Die mRNA-Expression des Mucin-Genmarkers Mucin 5AC (MUC5AC) wurde erst nach CSM-Exposition hochreguliert, was durch eine SARS-CoV-2-Infektion bei 24 hpi und 48 hpi in geringerem Maße weiter induziert wurde (Abb. 4D).

Auswirkung von Zigarettenrauch auf die durch SARS-CoV-2 verursachte Störung der Tight Junction und die Schleimhypersekretion. A Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen der Tight Junctions in gut differenzierten Atemwegsepithelzellen (MOI = 0,1). Maßstabsbalken, 200 nm. B-mRNA-Expression von ZO-1. C-mRNA-Expression von E-Cadherin. D-mRNA-Expression von MUC5AC. TJ, Tight Junctions; AJ, anhaftende Verbindungen; Ds, Desmosomen; Strg, Kontrolle; CSM, Zigarettenrauchmedium; SCoV2, SARS-CoV-2; H, Stunden. MOI von 2 wurde zur Analyse der Genexpression verwendet. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n = 5) ausgedrückt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für den einfaktoriellen ANOVA-Test mit Post-hoc-Analyse und Tukey-Korrektur

Funktionelle bewegliche Zilien bestanden normalerweise aus neun peripheren Mikrotubuli-Dubletts, die ein zentrales Paar von Singulett-Mikrotubuli umgeben [dh ein (9 + 2) Axonem, siehe Abb. 5A Strg-Mock-Gruppe] [34]. Nach einer SARS-CoV-2-Infektion mit CSM-exponierten Zellen wurde eine abnormale Ziliar-Ultrastruktur mit Fehlen und Fehlpositionierung des zentralen Paarapparats und geschwollenen beweglichen Zilien beobachtet (Abb. 5A CSM-SCoV2-Gruppe). Um die Ergebnisse weiter zu bestätigen, haben wir den beweglichen Zilienmarker (Forkhead Box J1, FOXJ1), den zentralen Paarapparatmarker (Serin/Threonin-Kinase 36, STK36) und den Basalkörpermarker (Kinesin-ähnliches Protein 27, Kif27) zur Kontrolle der Zilien nachgewiesen Orientierung [34, 35]. Alle Ziliarmarker wurden durch die CSM-Exposition sowohl bei 24 als auch bei 48 hpi herunterreguliert. Eine SARS-CoV-2-Infektion verursachte nur eine Verringerung der STK36-mRNA-Expression bei 24 und 48 hpi und der Kif27-mRNA-Expression bei 48 hpi, nicht jedoch der FOXJ1-mRNA-Expression bei 24 und 48 hpi (Abb. 5B-D). Eine vorherige CSM-Exposition führte jedoch zu einer weiteren Herunterregulierung der SARS-CoV-2-supprimierten Expression von FOXJ1- und Kif27-mRNA sowohl bei 24 als auch 48 hpi sowie der STK36-mRNA-Expression nur bei 48 hpi (Abb. 5B-D). Wir haben auch die Polarität der Zilien gemessen, indem wir die polare Ausrichtung des Basalkörpers unter TEM markiert haben. Allein bei der SARS-CoV-2-Infektion stimmten die Basalkörperpolaritäten ordnungsgemäß überein, nach CSM-Exposition und anschließender Virusinfektion war die Basalkörperpolarität jedoch falsch ausgerichtet und wurde in antiparallelen Ausrichtungen beobachtet (Abb. 5E). Darüber hinaus wurde in CSM-exponierten Zellen nach einer SARS-CoV-2-Infektion erstmals eine Regeneration neuer Flimmerzellen festgestellt, die aus einer Vakuolenstruktur und dem Basalkörper in der Nähe des Zellkerns in den vorhandenen Zellen der beweglichen Zilien wuchsen (Abb. 5F).

Wirkung von Zigarettenrauch auf die durch SARS-CoV-2 verursachte motorische Ziliarstörung. Eine repräsentative Transmissionselektronenmikroskopaufnahme beweglicher Zilienaxoneme. B-mRNA-Expression von FOXJ1. C-mRNA-Expression von STK36. D-mRNA-Expression von Kif27. E Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen der Basalkörperpolarität (rote Pfeile). F Es wurden repräsentative Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen der Zilienregeneration gezeigt. Strg, Kontrolle; CSM, Zigarettenrauchmedium; SCoV2, SARS-CoV-2; H, Stunden. MOI von 0,1 und MOI von 2 wurden für die Analyse von Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen bzw. der Genexpression verwendet. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n = 5) ausgedrückt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für den einfaktoriellen ANOVA-Test mit Post-hoc-Analyse und Tukey-Korrektur

In dieser Studie wurden gut differenzierte primäre HBECs vor der SARS-CoV-2-Infektion mit CSM behandelt. Die Ergebnisse zeigten einen schnellen Anstieg der Virusreplikation nach CSM-Exposition mit einem Anstieg der Schwere der Zellschädigung und der Anzahl infizierter Zellen. Die schnelle Wirkung von CS stimmte mit unseren Erkenntnissen zu den viralen Bindungsrezeptoren ACE2 und TMPRSS überein. Die SARS-CoV-2-Infektion von Atemwegsepithelzellen beinhaltet die Bindung des SARS-CoV-2-Spike-Proteins an ACE2-Rezeptoren nach einer Protease-vermittelten Aktivierung der Membranfusion über endozytische Maschinen, um die Virusreplikation zu fördern [36]. In einer früheren Studie erhöhte die direkte CS-Exposition auf das Atemwegsepithel die Anzahl der mit SARS-CoV-2 infizierten Zellen, was mit der aktuellen Erkenntnis übereinstimmt, dass eine schnelle Wirkung von CS auf die SARS-CoV-2-Infektion vorliegt [21]. Zur Untermauerung zeigte eine Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudie, dass Bronchialepithelzellen von COPD-Patienten mit Rauchen als wichtigstem Risikofaktor mit zunehmender Korezeptorexpression anfälliger für eine SARS-CoV-2-Infektion sind [37]. Es gab jedoch kontroverse Ergebnisse zur ACE2-Expression und zur CS-Exposition [23, 38]. Unsere Ergebnisse zeigten eine Hochregulierung der gesamten ACE2-Expression zu einem frühen Zeitpunkt nach der CSM-Exposition, es wurde jedoch kein Einfluss auf die SARS-CoV-2-induzierte gesamte ACE2-Expression beobachtet. Kürzlich wurde ACE2 in Kurzformen und Langformen von ACE2 unterteilt, wobei Kurzformen von ACE2 aufgrund des Fehlens hochaffiner Bindungsstellen nicht in der Lage waren, das SARS-CoV-2-Spike-Protein zu binden [32]. Diese Studie zeigte, dass die CSM-Exposition die SARS-CoV-2-induzierte Langform-ACE2-Expression sowie die TMPRSS2- und TMPRSS4-Expression zu einem frühen Zeitpunkt erhöhte, was darauf hindeutet, dass die CSM-Exposition den Viruseintritt mit schnellem Ausbruch erleichtern könnte.

Die IFN-Reaktion ist die wichtigste erste Verteidigungslinie gegen Viren. Virusinfektionen aktivieren bevorzugt die IFN-Antwort vom Typ I und Typ III [39]. Obwohl IFNs vom Typ I und Typ III ähnliche ISGs stromabwärts induzieren, führt die Signalübertragung von IFNs vom Typ I zu einer schnelleren Induktion und einem Rückgang der ISG-Expression (39, 40). Fehlt die IFN-Reaktion zur Kontrolle der anfänglichen Virusreplikation, kann die spät einsetzende IFN-Reaktion zu einer schweren Entzündung führen. Unsere Daten zeigten eine verzögerte Typ-I-IFN-Reaktion, die durch SARS-CoV-2 nach CSM-Exposition zu einem frühen Zeitpunkt induziert wurde, was darauf hindeutet, dass CSM die SARS-CoV-2-induzierte Typ-I-IFN-Reaktion hemmen könnte. CSM erhöhte auch die Expression von SARS-CoV-2-induzierten entzündlichen Zytokinen wie IL-6, was zu einer weiteren Verschlechterung des Ergebnisses führen könnte. Daher könnte CSM über die Hemmung des Typ-I-IFN-Signalwegs zu einer verschlimmerten Entzündung führen, und Typ-I-IFNs könnten eine potenzielle Therapie für COVID-19-Patienten sein [41], insbesondere bei Rauchern.

Der apikale Verbindungskomplex der Atemwegsepithelzellen ist essentiell und bildet die Barriere für die Virusinvasion, die aus engen und adhärenten Verbindungen sowie Desmosomen besteht [42]. Eine frühere Studie legte nahe, dass eine SARS-CoV-2-Infektion zu einer Störung der Tight Junctions durch Herunterregulierung von ZO-1 führte[43], was mit unseren aktuellen Erkenntnissen übereinstimmt. Wir fanden eine Herunterregulierung sowohl des Tight-Junction-Markers (ZO-1) als auch des Adherens-Junction-Markers (E-Cadherin) nach einer SARS-CoV-2-Infektion, und CSM schwächte die Expression beider Marker weiter ab. Unsere TEM-Ergebnisse zeigen jedoch eine vollständige Zerstörung des Verbindungskomplexes nur in den SARS-CoV-2-infizierten Zellen nach vorheriger CSM-Exposition, was auf eine irreversible Wirkung von CSM auf die durch SARS-CoV-2 induzierte Verbindungsstörung schließen lässt. Die übermäßige Schleimsekretion, ein wesentliches pathophysiologisches Merkmal der COPD, ist ein Merkmal der chronischen Bronchitis, die zu chronisch produktivem Husten und Auswurf führt [44]. Es ist bekannt, dass eine übermäßige Schleimsekretion das Risiko einer schweren COPD-Exazerbation aufgrund einer bakteriellen oder viralen Infektion erhöht [45]. Schleim wird hauptsächlich von Becherzellen an der Epitheloberfläche der Atemwege produziert, und MUC5AC ist das wichtigste gelbildende Muzin, das den vorherrschenden Subtyp bei COPD-Patienten darstellt [46]. Ein Anstieg des MUC5AC-Spiegels war mit der COPD-Initiierung, dem Fortschreiten, dem Exazerbationsrisiko und der gesamten Pathogenese verbunden, was darauf hindeutet, dass MUC5AC ein neuer Biomarker für die COPD-Prognose sein könnte [47]. In Übereinstimmung mit früheren Studien [48, 49] induzierte die CSM-Exposition eine Überexpression von MUC5AC mit einer weiteren Hochregulierung der MUC5AC-Expression nach einer SARS-CoV-2-Infektion, was darauf hindeutet, dass SARS-CoV-2 die Schleimhypersekretion verschlimmern könnte, was zu einer weiteren Verstopfung der Atemwege bei Rauchern und Rauchern führen könnte COPD-Patienten. Epithelzilien sind die erste Verteidigungslinie gegen Virusinvasion und mukoziliäre Clearance, die bei vielen Atemwegserkrankungen, einschließlich COPD, eine wichtige Rolle spielen [50, 51]. Die Störung der Ziliarmotilität wurde durch eine abnormale Ziliogenese, eine Zilienultrastruktur und eine Funktionsstörung der Zilienmotilität identifiziert [52]. Unsere Ergebnisse zeigten eine Funktionsstörung der Ziliarmotilität durch signifikante Herunterregulierung des beweglichen Ziliarmarkers, des Markers des zentralen Paarapparats und des Basalkörpermarkers sowie der Zilienorientierung nach CSM-Exposition und SARS-CoV-2-Infektion. TEM-Daten zeigten eine Anomalie in der Ziliar-Ultrastruktur mit fehlendem und falsch positioniertem zentralen Paarapparat und geschwollenen Zilien. In dieser Studie wurden neue Erkenntnisse über die Regeneration neuer Flimmerzellen, die aus einer Vakuolenstruktur und dem Basalkörper in der Nähe des Zellkerns in den vorhandenen Zellen beweglicher Zilien gewachsen sind, gefunden, was auf eine Abnormalität in der Ziliogenese hindeutet. Zusammengenommen verschlimmerte CSM die durch SARS-CoV-2 verursachten schweren beweglichen Ziliarstörungen.

Diese Studie ist jedoch nicht frei von Einschränkungen. Es ist unwahrscheinlich, dass die Exposition gegenüber CSM über Nacht repräsentativ für die Auswirkungen ist, die durch das Rauchen in der Vergangenheit beim Menschen verursacht werden können. Aufgrund technischer Schwierigkeiten behandelten wir die Zellen mit CSM auf der apikalen Seite der gut differenzierten HBECs anstelle einer direkten CS-Exposition. Darüber hinaus sind die Zusammensetzung des CSM in der löslichen Fraktion und der Verlust flüchtiger Bestandteile unbekannt, was die Ergebnisse beeinflussen könnte. Beispielsweise kann Nikotin als einer der Bestandteile von CS aufgrund seiner entzündungshemmenden Wirkung möglicherweise sogar COVID-19 verhindern und behandeln können [26]. Darüber hinaus konzentriert sich unsere Studie nur auf HBECs unter Verwendung des In-vitro-Modells. Atemwegsepithelzellen können mit infiltrierenden Entzündungszellen wie Neutrophilen oder Makrophagen interagieren, was weitere Untersuchungen erfordert, um den Mechanismus der Zell-Zell-Interaktion während einer SARS-CoV-2-Infektion mithilfe eines Co-Kultur-In-vitro-Modells aufzuklären. Schließlich sollten zukünftige Studien mit CS-exponierten passiv rauchenden Nagetiermodellen durchgeführt werden, um die Auswirkungen einer SARS-CoV-2-Infektion auf CS-induzierte Atemwegszellschäden in vivo zu untersuchen.

Trotz widersprüchlicher Ergebnisse in den Berichten darüber, ob CS-Exposition die SARS-CoV-2-Anfälligkeit erhöht und zu einer Verschlechterung der klinischen Ergebnisse führt, berichtete diese Studie über Ergebnisse, dass bei gut differenzierten primären HBECs die Behandlung mit CSM vor der SARS-CoV-2-Infektion zu einem Anstieg der Virusinfektion führte Replikation mit einem Anstieg der Schwere der Zellschädigung und der Anzahl infizierter Zellen, Hochregulierung der Langformen ACE2, TMPRSS2 und TMPRSS4, die zum Viruseintritt beitragen könnten. Darüber hinaus wurde eine verzögerte Typ-I-IFN-Reaktion beobachtet, was dazu führte, dass die IFNs nicht ausreichten, um die anfängliche Virusreplikation zu kontrollieren, und dass es zu einer schwereren Entzündung kam. Die CSM-Exposition verschlimmerte die durch SARS-CoV-2 verursachte Schädigung der Atemwegsepithelzellen und führte zur Störung der Epithel-Tight/Adherens-Verbindungen, zu einer übermäßigen Schleimsekretion und zu einer schweren Störung der Ziliarbeweglichkeit (Abb. 6).

Vorgeschlagenes schematisches Diagramm, das die Wirkung von Zigarettenrauch auf das Atemwegsepithel bei der Pathogenese einer SARS-CoV-2-Infektion zeigt.

Zusammengenommen deuten die aktuellen Ergebnisse der Multiparameter-Analyse von HBECs darauf hin, dass Rauchen ACE2 als Bindungsrezeptor für SARS-CoV-2 und TMPRSS2/4 hochreguliert, um den Viruseintritt zu erleichtern, was zu einer verstärkten Immunantwort des Wirts über die Hemmung von Typ I führt Interferon-Weg. Rauchen verschlimmert auch die Schädigung der Epithelzellen der Atemwege durch SARS-CoV-2 durch eine Störung der Integrität der Tight-Junction-Barriere, eine übermäßige Schleimsekretion und eine schwere Störung der Ziliarbeweglichkeit. Daher können die aktuellen Erkenntnisse zu einer erhöhten Krankheitsanfälligkeit bei schweren Erkrankungen beitragen. Diese Studie hat unser Verständnis der Pathogenese von COVID-19-assoziierten Atemwegsepithelschäden bei Rauchern über multifaktorielle Mechanismen erheblich erweitert.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Angiotensin-Converting-Enzym 2

Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle

Chronisch obstruktive Lungenerkrankung

Coronavirus Krankheit 2019

Zigarettenrauch

Zigarettenrauch mittel

Gabelkopfkasten J1

Menschliche Bronchialepithelzelle

Stunden nach der Infektion

Interferon

Interleukin

Interferon-stimuliertes Gen 15

Kinesin-ähnliches Protein 27

Vielzahl von Infektionen

Mucin 5AC

Myxovirus-Resistenzprotein 1

Schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2

Standardfehler des Mittelwerts

Serin/Threonin-Kinase 36

50 % infektiöse Dosis der Gewebekultur

Transmissionselektronenmikroskopie

Transmembrane Serinprotease

Tumornekrosefaktorα

Zonula okkluden-1

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Wir dankten Kevin Fung vom Department of Pathology, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, Hong Kong SAR, China für seine technische Unterstützung. Die Veröffentlichung wurde teilweise durch die Unterstützung des von den HKU Libraries gesponserten Open Access Author Fund der HKU Libraries ermöglicht.

Diese Studie wurde durch eine Auftragsforschung zu COVID-19 des Health and Medical Research Fund (COVID190201), Sonderverwaltungszone Hongkong, China (An JCWM) unterstützt. Diese Studie wurde auch durch Zuschüsse des National Institute of Allergy and Infectious Diseases, der National Institutes of Health, des Department of Health and Human Services (Vertrags-Nr. 75N93021C00016) und des Theme-Based Research Scheme (Ref: T11-309 705/21) unterstützt N) unter dem University Grants Committee der Sonderverwaltungsregion Hongkong (an MCWC).

Die Co-Erstautoren Rui Chen und Kenrie Pui-Yan Hui haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Medizin, School of Clinical Medicine, Medizinische Fakultät Li Ka Shing, Universität Hongkong, Sonderverwaltungszone Hongkong, China

Rui Chen, Yingmin Liang, Mary Sau-Man Ip und Judith Choi-Wo Mak

Zentrum für Immunologie und Infektion, Hong Kong Science Park, Sonderverwaltungszone Hongkong, China

Rui Chen, Kenrie Pui-Yan Hui, Malik Peiris und Michael Chi-Wai Chan

School of Public Health, Medizinische Fakultät Li Ka Shing, Universität Hongkong, Sonderverwaltungszone Hongkong, China

Klicken Sie auf „Herunterladen“, um Kenrie Pui-Yan Hui – Ka-Chun Ng mp3 youtube com zu speichern

Abteilung für Pathologie, Fakultät für klinische Medizin, Li Ka Shing-Fakultät für Medizin, Universität Hongkong, Sonderverwaltungszone Hongkong, China

John Malcolm Nicholls

Abteilung für Pharmakologie und Pharmazie, Medizinische Fakultät Li Ka Shing, Universität Hongkong, Sonderverwaltungszone Hongkong, China

Judith Choi-Wo Mak

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RC, KPYH, YL, MCWC und JCWM haben die Studie entworfen. RC führte die Experimente durch, sammelte die Daten, führte die Datenanalyse durch und erstellte den ersten Entwurf des Manuskripts. KPYH, KCN und JMN führten die Experimente durch und leisteten Hilfe bei den Experimenten. JCWM, MCWC, KPYH, YL, MP, JMN, MSMI haben zur Überarbeitung des Manuskripts beigetragen. Alle Autoren haben das endgültig eingereichte Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Michael Chi-Wai Chan oder Judith Choi-Wo Mak.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Die Einverständniserklärung des Patienten wurde eingeholt und die Genehmigung wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Universität Hongkong und der Hospital Authority (Hong Kong West) erteilt (IRB-Genehmigungsnummer: UW 20–862).

Unzutreffend.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Versuchsprotokoll für In-vitro-Modell. Schematischer Überblick über die Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur (ALI) eines gut differenzierten HBEC-Modells mit verschiedenen Behandlungen (n=5). Abb. S2 Wirkung von Zigarettenrauch auf die Virusreplikationskinetik in Atemwegsepithelzellen. Die Daten wurden mittels TCID50-Assay gemessen. Strg, Kontrolle; CSM, Zigarettenrauchmedium; SCoV2, SARS-CoV-2. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n=5) ausgedrückt. Abb. S3 Wirkung von Zigarettenrauch auf die SARS-CoV-2-induzierte Zytokin-IL-6-Freisetzung an der apikalen Seite der aus Zellkulturen gesammelten Überstände. Strg, Kontrolle; CSM, Zigarettenrauchmedium; SCoV2, SARS-CoV-2; H, Stunden. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM (n=5) ausgedrückt. *p<0,05 für den einfaktoriellen ANOVA-Test mit Post-hoc-Analyse und Tukey-Korrektur. Tabelle S1 Quantitative PCR-Primersequenzen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, R., Hui, K.PY., Liang, Y. et al. Eine SARS-CoV-2-Infektion verschlimmert durch Zigarettenrauch verursachte Zellschäden im primären Atemwegsepithel des Menschen. Virol J 20, 65 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02008-z

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Eingegangen: 3. November 2022

Angenommen: 08. März 2023

Veröffentlicht: 11. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02008-z

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