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Jul 09, 2023

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Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 13520 (2022) Diesen Artikel zitieren 1066 Zugriffe 2 Zitate 8 Altmetric Metrics Details SMIFH2 ist ein kleiner Molekülinhibitor der Formin-Familie von

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13520 (2022) Diesen Artikel zitieren

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SMIFH2 ist ein niedermolekularer Inhibitor der Formin-Familie der Zytoskelett-Regulatoren, der ursprünglich in einem Screening zur Unterdrückung der durch das Maus-Formin Diaphanous 1 (mDia1) induzierten Aktinpolymerisation identifiziert wurde. Trotz der weit verbreiteten Verwendung dieser Verbindung ist nicht bekannt, ob SMIFH2 alle menschlichen Formine hemmt. Darüber hinaus bleibt die Art der Protein-/Inhibitor-Wechselwirkungen unklar. Wir haben SMIFH2 gegen menschliche Formine getestet, die sechs der sieben Säugetierklassen repräsentieren, und eine Hemmwirkung gegen alle getesteten Formine festgestellt. Wir haben eine Reihe von SMIFH2-Derivaten synthetisiert und herausgefunden, dass viele Veränderungen die SMIFH2-Aktivität stören, die Substitution einer elektronenspendenden Methoxygruppe anstelle des Broms zusammen mit der Halogenierung des Furanrings die Wirksamkeit jedoch um etwa das Fünffache erhöht. Ähnlich wie SMIFH2 sind die aktiven Derivate auch Paninhibitoren für die getesteten Formine. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Wirksamkeit zwar verbessert werden kann, das Ziel der Unterscheidung zwischen hochkonservierten FH2-Domänen jedoch mit dem SMIFH2-Gerüst möglicherweise nicht erreichbar ist.

Mitglieder der Formin-Familie der Zytoskelettregulatoren sind mit einer Vielzahl essentieller eukaryotischer Zellprozesse verbunden1,2. Formine variieren in ihren biochemischen Funktionen, zu denen die Keimbildung von Aktinfilamenten, die prozessive Assoziation mit wachsenden Filamentenden, die Bündelung von Aktinfilamenten, die Bindung/Stabilisierung von Mikrotubuli und die Durchtrennung von Aktinfilamenten gehören (Übersicht von Chesarone et al.3). Diese Funktionen werden normalerweise von den Formin-Homologie-Domänen (FH) 1 und 2 im C-terminalen Teil des Proteins ausgeführt (Abb. 1B). Die FH2-Domäne ist von Hefe bis zum Menschen konserviert4,5 und ist ein überwiegend α-helikales Homodimer mit einer Donut-ähnlichen Architektur, die das dynamische „Stachelende“-Ende des Aktinfilaments umgibt6,7,8,9. Die FH1-Domäne ist eine unstrukturierte prolinreiche Region, die Profilin bindet, ein häufig vorkommendes Aktinmonomer-bindendes Protein10,11. Zusammen können diese Domänen das Wachstum von Aktinfilamenten modulieren12 und auch andere Stachelendbindungsproteine ​​verdrängen13,14. In vielen Formin-Isoformen enthält die N-terminale Region regulatorische Domänen, die die Aktivität der FH1- und FH2-Domänen unterdrücken15,16,17.

Formin-Konstrukte und Reinigung. (A) Phylogenetischer Forminbaum basierend auf DeWard et al.2 Um verschiedene menschliche Formine zu untersuchen, haben wir Vertreter von sechs der sieben Formin-Unterklassen von Säugetieren ausgewählt. (B) „FFC“-Konstrukte, die die FH1- und FH2-Domänen und alle C-terminalen Sequenzen umfassen, wurden für jedes Formin isoliert (DID, Diaphanous Inhibitory Domain; DAD, Diaphanous Autoregulatory Domain). (C) SDS-PAGE, die die Reinheit jedes rekombinanten Formin-FFC-Fragments nach Reinigung durch Coomassie-Färbung zeigt (siehe Abbildung S7 für nicht zugeschnittenes Gel).

SMIFH2 (1-(3-Bromphenyl)-5-(furan-2-ylmethylen)-2-thioxodihydropyrimidin-4,6(1H,5H)-dion) wurde in einem In-vitro-Screening nach Verbindungen entdeckt, die die mDia-FH2-Domäne hemmen , daher der Name Small Molecule Inhibitor of FH218. Es wird angenommen, dass SMIFH2 ein Pan-Formin-Inhibitor ist, basierend auf biochemischen Daten, die zeigen, dass es die Hefe-Formine Bni1, Fus1 und Cdc12, das Nematoden-Formin CYK-1 und das Maus-Formin DIAPH118 hemmen kann. Neuere Daten zeigen, dass SMIFH2 mit pflanzlichen Forminen interagiert, darunter unter anderem Formin-119 aus Arabidopsis. Die Annahme, dass SMIFH2 ein Pan-Inhibitor ist, wurde jedoch nie in vitro für verschiedene FH2-Domänen von Säugetieren getestet. Um zu untersuchen, wie Formine zu zellulären Prozessen beitragen, sind sowohl Pan-Inhibitoren als auch spezifische Inhibitoren nützlich. Es wurde über einen Isoform-spezifischen Inhibitor von Maus-Dia1 und Dia2, jedoch nicht von Dia3, berichtet, dessen Verwendung jedoch durch die geringe Löslichkeit in Zellkulturmedien behindert wurde20.

Inhibitoren kleiner Moleküle waren für die Untersuchung der Funktion des Zytoskeletts von unschätzbarem Wert. Dazu gehören Naturstoffverbindungen, die direkt auf Zytoskelettfilamente wirken21, sowie die meist synthetischen Verbindungen, die auf Zytoskelett-Bindungsproteine ​​wie SMIFH2, den Arp2/3-Inhibitor CK66622 und den Myosin-Inhibitor Blebbistatin und seine Analoga abzielen23. Aufgrund der Bedeutung der Formin-vermittelten Zytoskelettregulation in Eukaryoten wurde SMIFH2 in mindestens 324 Studien zur zellulären Rolle von Forminen beim Aufbau des Aktin- und Mikrotubuli-Zytoskeletts verwendet (Originalmanuskripte in einer Google Scholar-Suche nach „SMIFH2“, Mai). 2022).

Im Zusammenhang mit dieser weit verbreiteten Verwendung wurde über mehrere Off-Target-SMIFH2-Wechselwirkungen berichtet: eine mit dem Tumorsuppressor p5324 und eine andere mit mehreren Mitgliedern der Myosin-Superfamilie25. Letzteres ist besonders besorgniserregend, da Formine und Myosine beide Zytoskelettregulatoren sind und SMIFH2-induzierte Effekte auf das Zytoskelett in bestimmten Situationen schwer zu interpretieren sein können. Überraschenderweise hemmt SMIFH2 die Aktin-induzierte ATPase-Aktivität von Drosophila-Myosin 5 (IC50 ≈ 2 µM) stärker als Formin/vermittelte Aktin-Wechselwirkungen (IC50 ≈ 10–20 µM)25. Diese Off-Target-Wechselwirkungen hängen möglicherweise mit der Tatsache zusammen, dass SMIFH2 aufgrund der Elektrophilie seiner α/β-ungesättigten Dicarbonylalkylideneinheit26 als Pan-Assay-Interferenzverbindung (oder PAIN) klassifiziert wird. Sowohl die weit verbreitete Verwendung als auch die potenziellen Nachteile von SMIFH2 haben die Suche nach entweder optimierten Analoga von SMIFH2 oder sogar einer neuen Generation von Formininhibitoren motiviert.

In dieser Studie berichten wir über eine Struktur-Aktivitäts-Studie von SMIFH2 gegen eine Reihe verschiedener menschlicher Formine unter Verwendung des In-vitro-Pyren-Aktin-Polymerisationstests27. Wir stellen fest, dass SMIFH2 ein Pan-Inhibitor dieser menschlichen Formine ist und dass Störungen seiner Struktur die Aktivität, aber nicht die Spezifität modulieren.

SMIFH2 wurde aus einer Bibliothek arzneimittelähnlicher Moleküle aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, das Maus-Formin mDia1 in einem Pyren-Aktin-Polymerisationstest zu hemmen18. Wir verwendeten den Pyren-Aktin-Polymerisationstest, um die Hemmwirkung gegenüber einer Reihe menschlicher Formine zu charakterisieren, die sechs der sieben Klassen von Säugetier-Forminen repräsentieren (Abb. 1A). Diese Formine wurden rekombinant als konstitutiv aktive „FFC“-Fragmente (enthaltend FH1-, FH2- und C-terminale Regionen; Abb. 1B) exprimiert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt (Abb. 1C).

SMIFH2 und seine Analoga wurden wie in den experimentellen Verfahren beschrieben synthetisiert. In allen NMR-Charakterisierungsexperimenten wurde beobachtet, dass SMIFH2 eine Mischung aus E- und Z-Isomeren war, mit einer Verdoppelung jedes Protonenpeaks aufgrund der unterschiedlichen Umgebungen in jedem Isomer. In einigen Fällen wurde unmittelbar nach dem Auflösen von SMIFH2 eine ungleichmäßige Verteilung der Isomere beobachtet, wie für das Lösungsmittel deuteriertes Tetrahydrofuran (THF-d8) gezeigt wurde (Abb. 2). Nach 20-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur stellte sich bei dieser Probe ein 1:1-Isomerengemisch ein, wie anhand der äquivalenten Peakintegrationen für jedes Paar beurteilt wurde. Die Verschiebung von ungleichen zu gleichen Peakintegrationen weist darauf hin, dass die Gleichgewichtskonstante für den Isomerisierungsprozess nahe bei 1 liegt und dass das Molekül innerhalb einer experimentell relevanten Zeitskala zwischen diesen Isomeren austauscht. Aus der NMR-Analyse von SMIFH2 in deuteriertem Dimethylsulfoxid (DMSO-d8) ging hervor, dass das anfängliche Verhältnis der Isomere näher bei 1:1 lag als in THF-d8 beobachtet. Daraus schließen wir, dass die Äquilibrierungskinetik in DMSO-d8 schneller ist als in THF-d8. Unabhängig vom Lösungsmittel können wir nicht sagen, welcher Peak jedes Paars welchem ​​Isomer entspricht. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob beide Isomere oder nur ein Isomer die FH2-Domäne hemmt.

SMIFH2 ist eine Mischung aus Isomeren, die sich im Laufe der Zeit ausgleichen. 1H-NMR-Spektren derselben Probe wurden zu zwei Zeitpunkten aufgenommen. Das blaue Spektrum (unten) entspricht der SMIFH2-Probe unmittelbar nach der Vorbereitung in THF-d8. Die ungleichmäßigen Peakintegrationen sind in den Signalen für die Protonen A, B, C, D und E erkennbar. Das anfängliche Isomerenverhältnis wurde durch Integration der Hauptresonanz bei 8,25 ppm und der Nebenresonanz bei 8,33 ppm für Proton E zu 3,5:1 berechnet. Danach Nach 20 h bei 25 °C (rotes Spektrum; oben) waren die Peakintegrationen für jedes Isomer ähnlich, was die Äquilibrierung zu einem E:Z-Gemisch von ≈1:1 widerspiegelt (Isomerenverhältnis 1,1:1 durch Integration der Resonanzen bei 8,33 ppm und 8,25 ppm). ).

Alle FFC-Fragmente waren in Pyren-Actin-Polymerisationstests aktiv, gemessen an ihrer Fähigkeit, die Assemblierung über die Basisrate von Actin/Profilin allein hinaus zu stimulieren (Abb. 3, Vergleich der roten und grauen Kurven). Wie bereits berichtet, stimulierten diaphane verwandte Formine (DIAPH1 und DIAPH2) und invertiertes Formin 2 (INF2) den Zusammenbau bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen (5 nM). FMNL3, FMN2 und DAAM2 hatten eine mittlere Keimbildungseffizienz (20–25 nM Formin induzierte die Aktinpolymerisation, so dass der Steady State innerhalb von 2000 s erreicht wurde), und Delphilin (25 nM) hatte eine recht schwache Keimbildungsaktivität, wie bereits für Kaninchen-Skelettmuskel-Aktin berichtet28.

SMIFH2 weist eine breite Aktivität in allen menschlichen Formen auf. Bei jeder Titration wurde die Pyrenfluoreszenz auf 2 μM Aktin (5 % Pyren-markiert)/4 μM S. pombe Profilin überwacht. Die schwarze gestrichelte Linie zeigt Profilin/Aktin allein, und die rote Spur entspricht der Zugabe von Formin FFC zu Profilin/Aktin (5 nM DIAPH1, DIAPH2, INF2; 20 nM FMNL3; 20 nM FMN2; 25 nM DAAM2; 25 nM Delphilin). Die zunehmende Konzentration von SMIFH2 wird durch blaue Spuren angezeigt, wobei die µM-Konzentration rechts von jedem Diagramm angegeben ist. Das zugesetzte DMSO-Volumen war für alle Spuren gleich, unabhängig von der SMIFH2-Konzentration.

Um die Spezifität von SMIFH2 zu charakterisieren, haben wir den Inhibitor gegen jedes gereinigte Formin titriert und dabei das DMSO-Volumen für alle Polymerisationsreaktionen kontrolliert (Abb. 3, angezeigt durch blaue Spuren). In allen Fällen lag die Konzentration von SMIFH2 für eine 50-prozentige Hemmung (IC50) im Bereich von 10–20 µM. Dies ist vergleichbar mit dem gemeldeten Wert von 15 µM für Maus-Dia118. Unter den diaphanen Forminen hat SMIFH2 eine stärkere Wirkung auf DIAPH2 (Dia3) als auf DIAPH1 (Dia1), eine bemerkenswerte Umkehrung der Präferenz im Vergleich zu dem von Higgs und Mitarbeitern beschriebenen Inhibitor auf Chinoxalinbasis (Verbindung 2 in Gauvin et al.)20 .

Es ist bekannt, dass mehrere SMIFH2-Analoga ihre Hemmwirkung gegenüber mDia118 beibehalten oder verlieren. Wir wollten diesen Datensatz erweitern, um die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen im SMIFH2/Formin-Komplex umfassender zu charakterisieren. Alle 17 in Abb. 4 gezeigten Analoga wurden gemäß dem in den experimentellen Verfahren (Abb. 6) beschriebenen Schema synthetisiert und durch Protonen-NMR charakterisiert (Abb. S8). Jeder Inhibitor wurde auf mögliche Wechselwirkungen mit Aktin in Abwesenheit von Formin getestet (Abb. S3, S4). Bei den höchsten getesteten Konzentrationen stellten wir fest, dass einige Inhibitoren mäßige Auswirkungen auf die Polymerisation von 2 µM Aktin hatten (Abb. S3). Diese Effekte waren in Gegenwart von 4 µM Profilin weniger deutlich (Abb. S4), was darauf hindeutet, dass die Profilin/Aktin-Wechselwirkung die Inhibitor-Wechselwirkung maskieren oder die Polymerisation eines potenziellen Aktin/SMIFH2-Komplexes unterdrücken kann. Dieses Panel aus 18 Inhibitoren wurde gegen fünf Formin-FFC-Fragmente (DIAPH1, DIAPH2, INF2, FMNL3 und FMN2) getestet und die IC50-Werte wurden gemessen (Abb. 4 und Tabelle 1). Ein bemerkenswerter Trend in diesem Datensatz besteht darin, dass der oben für SMIFH2 erwähnte Mangel an Spezifität (Abb. 3) auch für seine Analoga gilt: Keine an SMIFH2 vorgenommenen Modifikationen führten zu einem selektiven Inhibitor, zumindest unter den fünf getesteten Forminen. Mit anderen Worten: Aktive Inhibitoren hemmten alle Formine und inaktive Inhibitoren zeigten keine Aktivität gegen alle getesteten Formine.

Strukturaktivitätsdaten für SMIFH2- und 17-Analoga, getestet gegen fünf menschliche Formine. Jeder einzelne Datenpunkt gibt einen IC50-Wert aus einer Titration des Inhibitors im Pyren-Actin-Assembly-Assay an. Der Durchschnitt und die Standardabweichung für jedes Formin/Analog-Paar sind in Tabelle 1 angegeben. Bedingungen: 2 µM Actin (5 % Pyren-markiert), 4 µM S. pombe Profilin, Formin (5 nM DIAPH1-FFC, 5 nM DIAPH2-FFC). , 5 nM INF2-FFC, 20–37,5 nM FMN2-FFC, 20 nM FMNL3-FFC), Inhibitor mit einem festen Volumen an DMSO. Aufgrund der geringen Löslichkeit wurde Verbindung 9 in DMF gelöst. Da wir IC50-Werte über 40 µM nicht zuverlässig messen können, werden diese Punkte an der Linie > 40 µM angezeigt. Einzelne IC50-Werte sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Es gab zwei Arten von Modifikationen am Thiobarbituratkern: Alkylierung oder Arylierung von N3 und Ersatz des Thiocarbonyls durch ein Sauerstoffcarbonyl (Atomnummerierung in Grau in der Struktur von Tabelle 1). Die letztgenannte Substitution (5) führte zu einem vollständigen Verlust der Hemmaktivität (Abb. 4 und Tabelle 1), was mit den von Kovar und Mitarbeitern berichteten Daten übereinstimmt (Verbindung 3 in Rizvi et al.18). Sowohl die Methylierung (2) als auch die Arylierung (4) von SMIFH2 N3 wurden gut vertragen, und das N3-Phenylanalogon (4) hatte eine drei- bis vierfach stärkere Hemmaktivität als SMIFH2. Überraschenderweise hatte das ethylsubstituierte Analogon (3) keine nachweisbare Aktivität. Dies war unerwartet, da die hohe Aktivität von Verbindung 4 zeigte, dass die Bindungstasche an der FH2-Domäne Substituenten von der Größe eines Phenylrings aufnehmen konnte. Ein charakteristisches Merkmal von PAINs sind unsinnige Struktur-Aktivitäts-Beziehungen26, und es ist möglich, dass die Aktivitätsdaten für die Verbindungen 2, 3 und 4 durch andere Faktoren außer der mit der Protein-/Inhibitorbindung verbundenen Änderung der freien Energie verfälscht werden. Die Toleranz von SMIFH2 gegenüber Methylierung (2) und Arylierung (4) von N3 unterstützt weiterhin ein Modell, bei dem ein Carbonyl-Tautomer (wie in Tabelle 1 dargestellt) und kein Thio- oder Sauerstoff-Enol29,30 die aktive Form von SMIFH2 ist. Die Aktivität der Verbindungen 2 und 4 weist auch darauf hin, dass die –NH-Gruppe von SMIFH2 höchstwahrscheinlich nicht als Wasserstoffbrückendonor in der Proteinbindungstasche fungiert.

Unterdessen hatten mehrere Veränderungen am Furanring-Teil von SMIFH2 dramatische Auswirkungen auf die Aktivität. Sowohl die Pyrrol- (6) als auch die Thiophen-Analoga (7) hatten keine nachweisbare Hemmwirkung auf eines der getesteten Formine. Andererseits wurde die Halogenierung des Furanrings an der C5'-Position, entweder mit Cl (15) oder Br (16), gut toleriert, während die Methylierung an derselben Position (17) die Aktivität aufhob. Dies steht im Einklang mit der hohen Aktivität eines Analogons mit einem anderen Halogen (I) an der 5'-Position, berichtet von Kovar und Mitarbeitern (Verbindung 2 in Rizvi et al.18). Wir haben ein Analogon mit einem verlängerten Linker zwischen dem Furan und den zentralen Ringen synthetisiert. Diese Verbindung (18) hatte eine mäßige Aktivität.

SMIFH2 hat ein Br in der Metaposition des N1-Rings (R2-Position in Tabelle 1). Der Effekt der Entfernung dieses Br wurde mit Verbindung 9 untersucht, die messbare, aber schwache bis minimale Aktivität zeigte. Verbindung 9 war in DMSO schlecht löslich und musste für Tests in DMF gelöst werden. Abgesehen von der vollständigen Entfernung des Br stellten wir fest, dass die Verschiebung dieses Br in die para-Position (8) die Hemmaktivität aufrechterhielt oder leicht verstärkte. Wir waren an den Auswirkungen einer Methoxygruppe auf den N1-Ring interessiert und haben erfolgreich das para-Methoxy-Analogon (10) synthetisiert. Während Verbindung 10 im Vergleich zu meta-Br (1) oder para-Br (8) SMIFH2 eine verringerte Aktivität aufwies, war die Substitution des Furans entweder durch Br oder Cl an der C5'-Position (11 bzw. 12) oder Br an der C4'-Position möglich. Position (13) zusätzlich zur N1-para-Methoxyphenylgruppe schien synergistische Wirkungen zu haben. Am auffälligsten war dies bei Verbindung 12, dem wirksamsten Inhibitor in unserer Reihe von Verbindungen. Die Kombination dieser beiden Substitutionen verringerte die IC50-Werte je nach Formin um das Zwei- bis Neunfache (Vergleich der Verbindungen 1 und 12). Beispielsweise wurde der IC50-Wert gegen INF2 von 10 ± 5 µM für SMIFH2 (1) auf 2 ± 1 µM für Verbindung 12 verringert. Im Gegensatz zum Einbau eines Halogens an den Furan-C4'- oder C5'-Positionen in der para-Methoxy-Reihe (11 , 12, 13) hatte die Zugabe eines Cl an Furan C5' (14) im Vergleich zu para-Br allein (8) keine erhöhte Wirksamkeit.

Zusammengenommen heben die Aktivitätsdaten für SMIFH2 und die Gruppe von 17 Analoga zwei wesentliche Komponenten der SMIFH2-Struktur hervor: den Thiocarbonyl- und den Furanring. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass SMIFH2-Derivate ihre Aktivität beibehalten, wenn die Struktur an der Thiobarbiturat-N3-Position und auch an den Meta- und Para-Positionen am N1-Phenylring und den 4'- und 5'-Positionen des Furanrings modifiziert wird. Trotz der in dieser Studie untersuchten chemischen Vielfalt konnten wir keinen isoformspezifischen Formininhibitor identifizieren. Ein solcher Inhibitor kann in einer anderen Region des chemischen Raums von SMIFH2 existieren, die hier nicht untersucht wird, wie z. B. ortho- und/oder mehrfache Substitutionen am N1-Phenylring oder Furane, die an ihrem 3'-Kohlenstoff an den Beta-Kohlenstoff gebunden sind, neben vielen anderen möglichen Modifikationen. Alternativ lässt die mangelnde Spezifität der Molekülgruppe in dieser Studie darauf schließen, dass ein spezifischerer Inhibitor möglicherweise ein Gerüst erfordert, das sich vom Thiobarbituratkern von SMIFH2 völlig unterscheidet, um zwischen hochkonservierten FH2-Domänen zu unterscheiden. Higgs und Mitarbeiter identifizierten einen Inhibitor auf Chinoxalinonbasis mit Spezifität für die diaphanen Formine20, was darauf hindeutet, dass ein spezifisches Targeting zwischen FH2-Domänen erreichbar ist.

Bisher sind keine Strukturdaten mit atomarer Auflösung für an die FH2-Domäne gebundenes SMIFH2 verfügbar, was die rationale Gestaltung struktureller Störungen des Inhibitors behindert. Dies steht im Gegensatz zum Arp2/3-Inhibitor CK66622, dessen Röntgenkristallstruktur als Ausgangspunkt für Berechnungen der Störung der freien Energie zur Optimierung der Inhibitor/Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde31. Die hier beschriebenen wirksameren Analoga könnten Kandidaten für Strukturstudien eines Protein/SMIFH2-Komplexes sein, insbesondere mit dem menschlichen Formin DIAPH2 (Ortholog von mDia3). Basierend auf den IC50-Werten könnte das SMIFH2-Analogon 12 eine höhere Affinität zu DIAPH2 haben als alle anderen gemessenen Formin/Inhibitor-Paare, obwohl dies durch Gleichgewichtsexperimente bestätigt werden müsste.

Nach unserem Kenntnisstand ist es ungewiss, wo SMIFH2 in der Taxonomie der kovalenten/nichtkovalenten oder reversiblen/irreversiblen Inhibitoren liegt. Sein α/β-ungesättigtes Dicarbonylmotiv ist wahrscheinlich ein Michael-Akzeptor, der mit nukleophilen Aminosäuren reagieren würde und SMIFH2 in die kovalente Kategorie einordnen würde32,33,34. Die Furansubstitution am β-Kohlenstoff von SMIFH2 legt nahe, dass die Hinzufügung einer Thiolgruppe reversibel sein könnte35. Es wurde festgestellt, dass ähnliche Verbindungen wie SMIFH2 mit einem modifizierten Thiobarbituratkern die Pilztyrosinase irreversibel hemmen36, entweder durch kovalente Modifikation eines Rests im aktiven Zentrum oder durch Induktion einer Proteinfehlfaltung. Zelluläre Studien mit SMIFH2 haben eine Umkehrung der Wirkung von SMIFH2 nach einem Auswaschen gezeigt37,38,39. Ob dies jedoch auf die Synthese neuer Proteine ​​oder die Dissoziation des SMIFH2/Formin-Komplexes zurückzuführen ist, ist unbekannt.

Motiviert durch das breite Spektrum an inhibitorischen Aktivitäten, die in unserer Struktur-Aktivitäts-Studie beobachtet wurden (Abb. 4 und Tabelle 1) und das Potenzial für kovalentes Targeting durch SMIFH2, verwendeten wir Computermodelle, um Unterschiede in der Molekülstruktur und Reaktivität zwischen dieser Gruppe von Molekülen zu untersuchen. Wir verwendeten Berechnungen der Gaußschen Dichtefunktionaltheorie auf der Theorie- und Basissatzebene B3LYP/6311G + + (d,p), um die Geometrie einer Teilmenge von zehn Molekülen zu optimieren, die aufgrund ihrer variablen Aktivitäten ausgewählt wurden. Abbildung 5A zeigt ihre optimierten Geometrien in Wasser für die E- und Z-Isomere. Die optimierte Geometrie war nicht empfindlich gegenüber Basissatz oder Lösungsmittel (Abb. S5). Insgesamt war die Molekülform bei allen Molekülen ähnlich, unabhängig von ihrer Hemmaktivität. Die Torsionswinkel für „periphere“ Ringe in Bezug auf den zentralen Thiobarbituratring lagen zwischen 89,9° und 91,5° für die Bindung, die N1 des zentralen Rings mit dem Äquivalent des Br-Phenylrings von SMIFH2 verbindet, und zwischen 179,5° und 180° für die Bindung Bindung, die Cβ des α/β-ungesättigten Thiobarbiturats mit C2' des Furanrings verbindet.

Computergestützte Analyse von SMIFH2-Derivaten. (A) Optimierte Geometrien von SMIFH2 (1) und neun in PyMOL ausgerichteten Analoga basierend auf dem Thioharnstoffanteil (N1-C2-N3) jedes Moleküls. (B) Globale Elektrophilie, dargestellt als Unterschied zu SMIFH2. (C) Grenzorbitalenergie aufgetragen, die die Lücke zwischen dem HOMO mit niedrigerer Energie und dem LUMO mit höherer Energie zeigt. (D) Unterschied in den Hirshfeld-Ladungen, berechnet für SMIFH2-Kohlenstoffe, die potenzielle Stellen für eine nukleophile Addition sind. Die spezifischen Kohlenstoffe werden durch einen roten Punkt in der beispielhaften Struktur von SMIFH2 (1) angezeigt. In den Feldern (B–D) sind weniger aktive Moleküle mit hellgrauen Balken und aktivere Moleküle mit dunkelgrauen Balken gekennzeichnet. Alle Strukturen, Energien und Ladungen wurden mit Gauß berechnet (siehe Experimentelle Verfahren für Ebenen der Theorie und Basissätze). Die Rohwerte für Elektrophilie und Ladung finden Sie in Abbildung S6.

Wir haben den Grad der Reaktivität von SMIFH2 und diesen neun Derivaten mithilfe eines globalen Elektrophilieindex40 untersucht, den wir aus Einzelpunktenergien wassersolvatisierter neutraler, anionischer und kationischer Spezies berechnet haben. Wir fanden einen Trend zu höherer Elektrophilie für aktive Inhibitoren (dunkle Balken in Abb. 5B). Mindestens ein inaktives Molekül (7), das anstelle des Furans ein Thiophen aufweist, weist jedoch einen Elektrophiliewert auf, der etwas größer als SMIFH2 ist (Abb. 5B). Dies weist darauf hin, dass die Elektrophilie möglicherweise eine Determinante, aber nicht die einzige Determinante der Aktivität ist. Im Einklang mit der höheren Elektrophilie hatten aktive Inhibitoren auch etwas kleinere HOMO/LUMO-Energielücken (Abb. 5C). Schließlich berechneten wir Hirshfeld-Ladungen für Kohlenstoffe, die potenzielle Orte eines nukleophilen Angriffs waren, nämlich die Carbonylkohlenstoffe und den Kohlenstoff in β-Position relativ zu den Carbonylen. Diese Ladungen korrelierten nicht mit der Aktivität (Abb. 5D). Insgesamt deuten unsere Berechnungsergebnisse darauf hin, dass diese SMIFH2-Derivate ähnliche Geometrien und Unterschiede in der Elektrophilie aufweisen.

Die weit verbreitete Verwendung von SMIFH2 in den zehn Jahren seit der grundlegenden Arbeit von Kovar und Mitarbeitern18 unterstreicht die Nachfrage nach niedermolekularen Formin-Inhibitoren. Zusätzlich zur Suche nach Formin-spezifischen Inhibitoren haben aktuelle Daten, die die Aktivität des Formin-Inhibitors SMIFH2 auf Myosine zeigen,25 eine Suche nach Formin-Inhibitoren mit minimalen Off-Target-Wechselwirkungen motiviert. Es wird interessant sein, die Reihe der Moleküle aus dieser Studie auf Myosinhemmung zu untersuchen und festzustellen, ob die Wirksamkeit gegen Myosine und die Wirksamkeit gegen Formine korrelieren. Für die Zukunft ist ein tieferes Verständnis der Mechanismen und der Spezifität niedermolekularer Inhibitoren, die auf Formine abzielen, wichtig, um die Rolle von Forminen in Zellen zu verstehen. Wir fanden heraus, dass viele Veränderungen zwar die SMIFH2-Aktivität stören, wir aber die Wirksamkeit um etwa das Fünffache steigern konnten. Es gelang uns jedoch nicht, die Spezifität zu erhöhen, was darauf hindeutet, dass die Wirksamkeit zwar verbessert werden kann, das Erreichen der Spezifität zwischen eng verwandten FH2-Domänen jedoch mit dem SMIFH2-Gerüst möglicherweise schwierig zu erreichen ist.

Alle Formin-FFC-Genfragmente wurden in einen modifizierten pET15b-Vektor mit einem N-terminalen 6-Histidin-Tag subkloniert, mit Ausnahme von DIAPH1, das einen C-terminalen 6-Histidin-Tag aufwies. Mehrere menschliche Gene wurden für E. coli codonoptimiert und als g-Blöcke von Integrated DNA Technologies bezogen. FFC-Fragmente wurden mit Aminosäurenummern definiert: DIAPH1 (Transomic BC117257, AA 549–1262; analog zu UniProt O60610-1, AA 558–1272), DIAPH2 (NP_009293 / UniProt O60879-2, AA 553–1096), FMNL3 (NP_001354764). .1 / UniProt Q8IVF7-1, AA 481-1028), FMN2 (NP_064450.3 / UniProt Q9NZ56-1, AA 1192-1722), Delphilin (NP_001138590 / UniProt A4D2P6-1, AA 744-1211), INF2 (NP_071934. 3 / UniProt Q27J81-1, AA 469–1249) und DAAM2 (NP_001188356.1 / UniProt Q86T65-3, AA 486–1068). Vollständige DNA- und Aminosäuresequenzen sind in den Hintergrundinformationen enthalten.

Formin-FFC-Proteine ​​wurden in ROSETTA-DE3 E. coli-Zellen (Novagen) exprimiert, indem die Zellen bei 37 °C in Terrific Broth bis zu einer optischen Dichte von 0,5–1,0 bei 600 nm wachsen gelassen wurden und die Temperatur 1 Stunde lang auf 18 °C gesenkt wurde. Zugabe von 250 μM Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) und Wachstum über Nacht (≈12–17 h) bei 18 °C unter Schütteln bei 250 U/min. Die Zellen wurden geerntet, mit 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und vor der Lagerung bei –80 °C schockgefroren.

INF2-FFC-exprimierende Zellen wurden in Ni-NTA-Lysepuffer [500 mM NaCl, 50 mM NaPi pH 7,5, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Dithiothreitol (DTT)], ergänzt mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), lysiert. , 4 µg/ml DNaseI (Sigma #DN25), 2000-fach verdünnter Proteaseinhibitor-Cocktail (Sigma P8849). Die Zellen wurden durch French Press lysiert und dann 30 Minuten lang bei 40.000 × g zentrifugiert. Das geklärte Lysat wurde über eine 2-ml-HisTrap-Säule (Cytiva) geleitet und mit Ni-NTA-Lysepuffer, ergänzt mit 500 mM Imidazol, eluiert. Das eluierte Protein wurde auf einer Superdex75 16/600-Säule (Cytiva) gelfiltriert, die mit SEC-Puffer [150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7, 1 mM EDTA, 0,5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)] äquilibriert war. Die Reinheit wurde durch SDS-PAGE beurteilt und das Protein in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

DAAM2-FFC-exprimierende Zellen wurden lysiert, zentrifugiert und über eine HisTrap-Säule geleitet, wie oben für INF2 beschrieben. Reine Fraktionen wurden gepoolt und über eine PD10-Säule (Cytiva) in SEC-Puffer gepuffert, bevor über Nacht mit 1:1 Glycerin:SEC-Puffer dialysiert wurde. Aliquots wurden schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

DIAPH2-FFC-exprimierende Zellen wurden von French Press in Ni-NTA-Lysepuffer, ergänzt mit PMSF, DNaseI und Proteaseinhibitor-Cocktail, lysiert und wie für INF2 beschrieben zentrifugiert. Geklärte Lysate wurden 1 Stunde lang bei 4 ° C mit Ni-NTA-Harz (Thermo Sci) nutiert. Das Harz wurde mit 25 Säulenvolumina (CV) Ni-NTA-Lysepuffer und 25 CV Ni-NTA-Lysepuffer, ergänzt mit 10 mM Imidazol, gewaschen, bevor es mit Lysepuffer, ergänzt mit 500 mM Imidazol, eluiert wurde. Das eluierte Protein wurde über eine PD10-Säule in S-Puffer (10 mM NaCl, 10 mM PIPES pH 6,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) gepuffert. Das Protein wurde auf eine 1-ml-SP-FF-Kationenaustauschersäule (Cytiva) geladen und mit einem Gradienten von 10 bis 500 mM NaCl über 30 CV eluiert. Ausgewählte Fraktionen wurden über eine PD10-Säule in SEC-Puffer ausgetauscht und dann über Nacht in 1:1 Glycerin:SEC-Puffer dialysiert. Aliquots wurden schockgefroren und bei –80 °C gelagert. FMN2-FFC-exprimierende Zellen wurden in einem modifizierten Ni-NTA-Lysepuffer mit pH 6,5 lysiert. Der Rest des Reinigungsprotokolls war identisch mit dem für DIAPH2-FFC beschriebenen.

FMNL3-FFC-exprimierende Zellen wurden in TALON-Extraktionspuffer (300 mM NaCl, 50 mM NaPi pH 8,0, 1 mM β-Mercaptoethanol (βME)), ergänzt mit 1 mM PMSF und 4 µg/ml DNaseI, lysiert. Nach der Lyse und Zentrifugation wie oben für INF2-FFC beschrieben wurde der Überstand mit 1 ml TALON-Harz (Takara) 30 Minuten lang bei 4 °C nutiert. Das Harz wurde mit 25 CV TALON-Extraktionspuffer und dann mit 25 CV TALON-Waschpuffer (300 mM NaCl, 50 mM NaPi pH 7, 1 mM βME) gewaschen, bevor es mit TALON-Waschpuffer, ergänzt mit 200 mM Imidazol, eluiert wurde. Das eluierte Protein wurde gegen 50 mM NaPi pH 7, 50 mM NaCl, 1 mM DTT dialysiert, auf eine SP-FF-Kationenaustauschersäule geladen und mit einem Gradienten von 50 bis 500 mM NaCl über 30 CV eluiert. Die Fraktionen wurden gegen S-Puffer dialysiert, auf eine SP-FF-Säule geladen und mit einem Stufengradienten von 10 mM NaCl bis 500 mM NaCl eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden auf eine mit SEC-Puffer äquilibrierte Superdex200 10/300-Säule (Cytiva) geladen. Reine Fraktionen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert. FMNL3 wurde auch in einem Protokoll gereinigt, bei dem die erste SP-FF-Säule übersprungen wurde, und es gab keinen Unterschied in der Aktivität oder Reinheit.

DIAPH1-FFC-exprimierende Zellen wurden durch einen Sondenbeschaller in TALON-Extraktionspuffer, ergänzt mit PMSF und DNaseI, lysiert. Das Formin wurde unter Verwendung von TALON-Harz wie oben für FMNL3-FFC beschrieben gereinigt. Eluierte Fraktionen wurden gegen Q-Puffer (10 mM Tris, pH 8, 1 mM DTT) über Nacht mit 100 Einheiten Thrombin dialysiert, um den C-terminalen Histidin-Tag abzuspalten. Das gespaltene Protein wurde auf eine monoQ-Anionenaustauschersäule (Cytiva) geladen und mit einem Gradienten von 0 bis 500 mM KCl über 30 CV eluiert. Halbreine Fraktionen wurden mithilfe einer PD10-Säule in TALON-Extraktionspuffer gepuffert und mit TALON-Harz inkubiert, um ungespaltenes Protein zu entfernen. Die Fraktion, die TALON nicht band, wurde gesammelt und gegen Q-Puffer und dann 1:1 Glycerin:Q-Puffer dialysiert. Dies führt zu einer Version von DIAPH1-FFC, die am C-Terminus um etwa 10–20 Reste verkürzt ist, wie durch MALDI-Massenspektrometrie ermittelt (Daten nicht gezeigt).

Delphilin-FFC wurde wie für die menschliche FFC-Isoform28 beschrieben gereinigt. Profilin aus Schizosaccharomyces pombe wurde in einem pET-Plasmid in BL21-DE3*-Zellen exprimiert und wie beschrieben gereinigt41. Wir haben diese Isoform von Profilin gewählt, da ihre Wechselwirkung mit Aktin im Vergleich zu anderen Profilinen weniger empfindlich auf die Aktinmodifikation bei Cys73442 reagiert. Actin wurde aus Kaninchenskelettmuskeln gereinigt und wie beschrieben mit Pyreniodacetamid markiert42. Für Pyren-markiertes Aktin wurde die Pyrenkonzentration unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 21.978 M−1 cm−1 bei 344 nm berechnet, und die Aktinkonzentration wurde unter Verwendung des Korrekturfaktors von 0,127 bei 290 nm berechnet ([Aktin] = (A290 −). 0,127 × A344) × 38 μM). Extinktionskoeffizienten für Formine bei 280 nm wurden mit Expasy ProtParam43 berechnet: DIAPH1 (22.920 M−1 cm−1), DIAPH2 (25.900 M−1 cm−1), FMNL3 (28.420 M−1 cm−1), FMN2 (36.900 M). −1 cm−1), Delphilin (25.440 M−1 cm−1), INF2 (47.440 M−1 cm−1) und DAAM2 (29.910 M−1 cm−1).

Zur Herstellung von SMIFH2 und seinen Analoga (Abb. 6) wurden N-Aryl-substituierte Thioharnstoffe (A, X = S, R' = H) durch Behandlung der entsprechenden Aniline mit Ammoniumthiocyanat in wässriger Säure hergestellt. Kaliumcyanat ergab das Harnstoffzwischenprodukt (A, Et, Ph). Die Reaktion der (Thio)harnstoffe A mit Diethylmalonat und Natriumethoxid in Ethanollösung29 bildete den Thiobarbitursäurekern der Zwischenprodukte B. Die Synthese von SMIFH2 und Analoga (C) wurde durch Knoevenagel-Kondensation mit einer Auswahl von Aldehyden45,46, entweder unten, abgeschlossen Standard-Rückflussbedingungen oder Verwendung eines Mikrowellenreaktors. SMIFH2 und seine Analoga bildeten Mischungen von E/Z-Isomeren und wurden durch 1H-NMR und in ausgewählten Fällen 13C-NMR und/oder HRMS charakterisiert. Weitere experimentelle Details und Charakterisierungsdaten sind in den Hintergrundinformationen enthalten.

Syntheseschema für SMIFH2-Analoga.

Die Tests wurden wie beschrieben durchgeführt47. Kaninchen-Skelettmuskel-Aktin (5 % Pyren markiert) wurde 2 Minuten lang bei 25 °C mit 200 μM EGTA und 50 μM MgCl2 inkubiert, um Ca-Aktin in Mg-Aktin umzuwandeln. Wenn es in das Experiment einbezogen wurde, wurde ein Molverhältnis von 2:1 Profilin mit Actin 2 Minuten lang bei 25 °C inkubiert, bevor es in Mg-Actin umgewandelt wurde. Die Polymerisation wurde durch Zugabe von Polymerisationspuffer (KMEH, Endkonzentration: 10 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1 mM MgCl2) initiiert. Vor dem Mischen von KMEH mit Aktin wurden Formine und dann der Inhibitor in DMSO oder DMF in einer Menge von ≤ 1 % des Gesamtvolumens zugegeben. Schließlich wurde diese Mischung schnell mit Mg-Actin gemischt, wobei vor der Messung eine Totzeit von etwa 10–20 s eingehalten wurde. Die Fluoreszenz wurde alle 15 s mit einem TECAN F200 Pro mit λex = 360 ± 17 nm und λem = 415 ± 10 nm überwacht. Unabhängig von der Inhibitorkonzentration wurde jeder Vertiefung das gleiche Volumen an organischem Lösungsmittel (DMSO oder DMF) zugesetzt.

SMIFH2-Isomere und ihre chemischen Analoga wurden mit dem Programm Avogadro48 konstruiert. Alle quantenmechanischen Berechnungen wurden mit Gaussian 16 (Versionen A-2016 und C-2019)49 durchgeführt. Geometrieoptimierungen, Einzelpunktenergie und Hirshfeld-Populationsberechnungen wurden mit der uneingeschränkten (U) B3LYP-Funktion mit dem Basissatz 6–311 + G(d,p)50,51,52,53,54,55,56,57 durchgeführt. 58,59,60,61,62. Für Geometrieoptimierungen wurde das Schlüsselwort opt ​​auf die Option „tight“ gesetzt, um eine ausreichende Konvergenz sicherzustellen. Die anfängliche Optimierung für alle Verbindungen wurde im Vakuum durchgeführt und weiter für die in dieser Studie beschriebenen Solvatisierungsberechnungen verwendet. Einzelpunktenergieberechnungen für eine globale Elektrophilieanalyse im neutralen, anionischen und kationischen Zustand wurden mit der uneingeschränkten (U) PW6B95-Funktion, ergänzt durch die empirische D3-Diffusionsfunktion von Grimme et al. und der aug-cc-pVTZ-Basis, durchgeführt set63,64,65,66,67. Das SCRF-Modell des polarisierbaren Kontinuums (PCM) wurde verwendet, um ein implizites Wasser als Lösungsmittel zu modellieren. Optimierte Geometrien wurden mit PyMOL68 visualisiert.

Zur Berechnung der globalen Elektrophilie (ω) verwendeten wir die Konvention von Parr et al. ω = µ2/(2η) wobei µ und η das elektronische chemische Potential bzw. die chemische Härte darstellen40,69,70,71,72. Ionisierungsenergie und Elektronenaffinität wurden verwendet, um µ und η zu berechnen, wie von De Vleeschouwer et al.73 definiert. Wir verwendeten die Funktion (U) PW6B95-D3 und den Basissatz aug-cc-pVTZ wie oben beschrieben, um die globale Elektrophilie von SMIFH2 zu bestimmen und seine Analoga genauer74.

Charakterisierungsdaten für in dieser Studie synthetisierte Verbindungen sind in den Hintergrundinformationen enthalten. Die zur Berechnung der Durchschnittswerte in Tabelle 1 verwendeten Daten sind in Tabelle S1 aufgeführt. Zusätzliche Datensätze, die während der aktuellen Studie generiert wurden, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren würdigen die Arbeit der Studenten des Advanced Chemical Synthesis Laboratory (Amber Scharnow, Anna Yusov, Jacqueline Chou, Karen Montero, Karol Francisco, Kelsey Lynch, Kiana Harris, Lina Davidson, Maria Paley, Tahrima Jalil, Aisha Hasan, Amanda Sosnowski, Andromeda). Urquilla, Choi Mak, Emeline Nguyenduy, Isabel Klein, Jenny Lam, Rachel Dziatko, Ataa Amponsah, Elizabeth Witta, Erica Christensen, Hannah Wentz, Irene Golden, Isabelle Rocroi, Rafaela Brinn, Alaina Hartnett, Allison Forsberg, Anna Hurdle, Emily Latif, Genevieve Nemeth, Janine Sempel, Jessica Glynn, Lucy Zorzano, Shoshana Williams, Tasneem Elkoush, Wendy Xie, Dominique Macaluso, Emily Miura-Stempel, Erika Amemiya, Isabel Hernandez-Rodriguez, Jennifer Niola, Juliet Lee, Kalina Ko, Maya Hoffman, Michelle Lin, Natasha Reich). Dina Merrer, Marisa Buzzeo und Dalibor Sames für hilfreiche Diskussionen, Rabina Lakha für die Aktinreinigung, Grace Nickel für ihre Hilfe bei der Molekularbiologie.

Diese Arbeit wurde von der Research Corporation for Scientific Advancement (Cottrell-Auszeichnung Nr. 25929 an CLV), dem Barnard College und XSEDE (Zuteilung Nr. MCB200054 an CLV) unterstützt. Das NMR-Spektrometer wurde von der NSF Division of Chemistry unterstützt (MRI Award #1827936).

Fakultät für Chemie, Barnard College, New York, NY, USA

Marina Orman, Maya Landis, Aisha Oza, Deepika Nambiar, Joana Gjeci, Kristen Song, Vivian Huang, Amanda Klestzick, Carla Hachicho, Su Qing Liu, Judith M. Kamm, Jean J. Vadakkan, Christian M. Rojas und Christina L. Vizcarra

Abteilung für Pathologie und Zellbiologie, Columbia University Medical Center, New York, NY, USA

Francesca Bartolini

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MO, ML, DN, JG, KS, VH, AK, CH, SQL, JMK, JJK, CMR und CLV erfassten und analysierten Daten. AO und JMK führten eine rechnerische Analyse durch. Von MO, SQL, JMK, FB, JJK, CMR und CLV entworfene Experimente. AO, DN, JG, FB, CMR und CLV haben das Manuskript erstellt. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Christina L. Vizcarra.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Orman, M., Landis, M., Oza, A. et al. Veränderungen am Breitband-Formininhibitor SMIFH2 modulieren die Wirksamkeit, nicht jedoch die Spezifität. Sci Rep 12, 13520 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17685-z

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Eingegangen: 04. Juni 2022

Angenommen: 29. Juli 2022

Veröffentlicht: 08. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17685-z

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